FcγRIIB缺失促進順鉑誘導的急性腎損傷小鼠腎組織巨噬細胞浸潤*＊

金筱茜，吳通前，馬 嵐，袁 銳，楊 丹，周 玲，高 健，王 珺，周海燕，余 芳，＊＊＊

(1.貴州醫科大學臨床微生物及免疫學教研室，貴州貴陽 550004;2.貴州醫科大學附院臨床醫學研究中心，貴州 貴陽 550004;3.貴州醫科大學附院臨床檢驗中心，貴州貴陽 550004)

順鉑是治療卵巢癌、睪丸癌等多種癌癥最有效的細胞毒性藥物之一［1－2］，具有較好的療效，但可引起以腎小管壞死為主要病理改變的急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)［3］，這一副作用限制了順鉑在化療中的使用。AKI病理生理學涉及免疫細胞激活［4］，巨噬細胞作為免疫細胞，在腎損傷中發揮重要作用［5］。腎損傷時單核細胞迅速浸潤腎臟，分化為巨噬細胞，導致腎小管早期損傷［6－8］。免疫球蛋白 Fc受體IIB(FcγRIIB)屬于免疫球蛋白家族，可表達于巨噬細胞表面，因其特有的結構免疫受體酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs，ITIM)，可通過磷酸化過程傳遞抑制性信號［9－10］。在腎小球腎炎動物模型中，降低單核/巨噬細胞系表達FcγRIIB可減輕腎小球白細胞浸潤，從而減輕病情［11］。巨噬細胞可分為促炎性巨噬細胞(M1)抗炎巨噬細胞(M2)［12］，持續損傷反應中，M1通過分泌炎癥因子，引起腎小管細胞凋亡，誘導腎損傷和纖維化;在一定的微環境中，抗炎巨噬細胞(M2)分泌可再生的營養因子，減少炎癥，促進傷口愈合和腎臟恢復［13］。目前在順鉑誘導急性腎損傷中FcγRIIB缺失對巨噬細胞及AKI病情的影響還不明確，因此本研究通過順鉑構建野生型及FcγRIIB基因敲除小鼠AKI模型，探究FcγRIIB在AKI中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、材料與試劑

8～10周的雄性C57BL/6背景下FcγRIIB基因敲除小鼠(FcγRIIB－/－)由哥德堡大學 MIVAC醫學實驗動物中心贈予，10周的雄性C57BL/6野生型小鼠(Wildtype，WT)購自北京華富康生物科技有限公司。實驗小鼠飼養于特定無病原體(SPF)的動物實驗室，22℃恒溫、相對濕度為50%～70%、12 h光/暗周期。本實驗方案經貴州醫科大學動物保護委員會倫理指導批準并實施(證號NO 2517098)。順鉑(美國Sigma公司)，血清肌酐試劑盒(南京建成生物有限公司)，血清尿素氮試劑盒(南京建成生物有限公司)，酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(武漢華美)，多聚甲醛(美國Sigma公司)，蘇木素－伊紅(HE)試劑盒(中國索萊寶有限公司)，CD68(Proteintech Group，Inc，武漢)，山羊抗兔二抗(中國中杉金橋 ZB－2301);引物(上海生工)，The SYBR Green real time PCR kit(Applied Biosystems)，總RNA提取試劑盒(Tian-GenDp 419)，The PrimeScript RT reagent Kit with a gDNA Eraser(TAKARA BIO INC RR047A)，PerCP-cy5.5 Anti-F4/80(eBioscience)，PE-CD86(BD Biosciences)，APC-CD206(BD Biosciences)。

1.2 方法

1.2.1 分組及動物模型 雄性WT小鼠和FcγRIIB－/－小鼠，體質量約 20 g，按照每組 5 只隨機分為 WT 對照組(WT-Control，WC)，WT AKI模型 組 (WT-Model，WM)，FcγRIIB－/－對 照 組(FcγRIIB－/－-Control，FC)和 FcγRIIB－/－AKI模型組(FcγRIIB－/－-Model，FM)4 組。WM 和 FM 組腹腔注射20 mg/kg體質量的順鉑，WC和FC組腹腔注射等量生理鹽水。

1.2.2 樣本采集 造模72 h后麻醉后處死小鼠，采集小鼠腋動脈血，離心后取血清用于生化測定。分離小鼠左腎，置于10%中性福爾馬林溶液中保存，用于病理蘇木素－伊紅(HE)染色和免疫組化檢測。分離小鼠右腎，以冠狀面等分成3等分，其中1/3提取腎臟單個細胞用于流式細胞術檢測、1/3冰上勻漿后檢測組織局部炎性因子、1/3勻漿后提取腎臟mRNA。

1.2.3 生化測定 按照生化試劑盒操作檢測血清尿素氮(BUN)和血清肌酐(Scr)，評估小鼠AKI模型是否成功。

1.2.4 HE染色 腎組織HE染色評估順鉑誘導AKI模型是否成功，以腎小管上皮腫脹、刷狀緣脫落、空泡變性為基礎，采用半定量評分法，每張切片(400×)取相同組織結構部位隨機10個視野，0、1、2、3、4 分分別表示損傷面積 ＜10%、10% ～ ＜25%、25～＜50%、50～ ＜75%、≥ 75%，評分后計算其平均值，評估腎小管壞死(ATN)程度［14］。

1.2.5 腎組織巨噬細胞浸潤情況檢測 免疫組織化學檢測(CD68)腎組織巨噬細胞浸潤情況，隨機選取4個高倍視野，根據陽性細胞百分比及陽性細胞染色強弱進行評分，無陽性細胞為0分，陽性細胞總數＜25%為1分，25% ～49%為2分，≥50%為3分;無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩項乘積即為其評分，＜3分為陰性，≥ 3 分為陽性［15］。

1.2.6 腎組織腫瘤壞死因子α(TNF-α)、單核細胞趨化因子(MCP-1)檢測 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測腎臟組織勻漿TNF-α及MCP-1，按試劑盒說明書進行操作。

1.2.7 腎組織MCP-1、MCP-1α、MCP-1β mRNA檢測 提取腎臟mRNA，應用熒光定量聚合酶鏈反應(Q-PCR)檢測MCP-1(CCL2)、MCP-1α(CCL3)及MCP-1β(CCL4)相對表達量。CCL2引物序列為 F-GCCTGCTGTTCACAGTTGC，R-CAGGTGAGTGGGGCGTTA，CCL3引物序列為 F-ATGAAGGTCTCCACCACTGC，R-CCCAGGTCTCTTTGGAGTCA;CCL4引物序列為F-CAAACCTAACCCCGAGCAACAC，R-GGTCTCATAGTAATCCATCCAAAGC。

1.2.8 腎組織巨噬細胞亞型檢測 提取腎臟單個細胞后，流式細胞儀(Navios，Backman)檢測 F4/80+CD86+(M1)、F4/80+206+(M2)巨噬細胞。抗－小鼠 PerCP-cy5.5 Anti-F4/80、PE-CD86、APCCD206單克隆抗體4℃避光孵育30 min，與同種屬來源陰性抗體作為陰性對照，上機檢測，使用Flowjo軟件(Tree Star Inc.，Ashland，OR)進行分析。

1.3 統計學方法

應用SPSS22.0及GraphPad Prism6軟件進行數據分析，計量資料采用均數±標準差(±s)表示，數據比較采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 血清Scr及BUN

與FC組和WC組相比，FM組和WM組Scr及BUN均明顯升高，差異有統計學意義(P＜0.01);FM組Scr和BUN較WM組顯著升高，差異有統計學意義(P＜0.01)，提示順鉑已誘導小鼠AKI，且FcγRIIB缺失可加重AKI。見表1。

表1 各組小鼠血清Scr及BUN(±s)Tab.1 The effect of FcγRIIB loss on serum Scr and BUN

表1 各組小鼠血清Scr及BUN(±s)Tab.1 The effect of FcγRIIB loss on serum Scr and BUN

(1)與WC組比較，P＜0.05;(2)與FC組比較，P＜0.05;(3)與WM組比較，P＜0.05

組別 血清Scr(μmol/L) BUN(mmol/L)WC組57.83±5.806 7.261±0.498 2 WM組 166.9±16.32(1) 14.35±1.265(1)FC組 67.09±2.875 7.389±0.351 2 FM組 253.0±29.02(2)(3) 19.60±1.235(2)(3)

2.2 腎組織學

FM組和WM組腎小管上皮腫脹、刷狀緣脫落、空泡變性，其腎小管壞死(ATN)評分明顯高于FC組和WC組，差異具有統計學意義(P＜0.01);且FM組ATN評分高于WM組，差異具有統計學意義(P＜0.01)。提示順鉑已誘導小鼠AKI，且FcγRIIB缺失可加重AKI。見圖1。

圖1 各組小鼠腎臟組織(HE，×400)及ATN評分Fig.1 The effect of FcγRIIB loss on kidney tuber damage

2.3 腎臟組織TNF-α、MCP-1表達

FM組、WM組腎臟組織TNF-α、MCP-1表達水平顯著高于FC組和WC組，差異有統計學意義(P＜0.01);且FM組腎臟組織TNF-α、MCP-1表達水平較WM組顯著升高，差異有統計學意義(P＜0.01)，見圖2。

圖2 腎臟組織勻漿中TNF-α，MCP-1表達水平Fig.2 The effect of FcγRIIB loss on levels of TNF-α，MCP-1 in kidney homogenates

2.4 腎臟組織巨噬細胞浸潤情況及類型

免疫組織化學結果顯示，FM組、WM組腎組織巨噬細胞浸潤增多(圖3A)，并且FM組浸潤更多(圖3B)，差異具有統計學意義(P＜0.01)。腎臟單個細胞流式細胞術檢測結果顯示，與對照組相比，M1類細胞在FM組及WM組有增多趨勢，但差異無統計學意義(圖3C)，M2類巨噬細胞表達未見明顯差異(圖3D)。

2.5 腎組織CCL2、CCL3、CCL4 mRNA表達

與WC組和FC組相比，WM組和FM組CCL2、CCL4 mRNA表達增加(P＜0.05)，CCL3 mRNA表達有增高的趨勢，但差異無統計學意義(P＞0.05)。FM組腎組織CCL2、CCL4 mRNA表達水平增加較WM組更為明顯(P＜0.05)，CCL3 mRNA表達較WM組有增高的趨勢，但差異無統計學意義(P＞0.05)。見圖4。

3 討論

順鉑聯合其他藥物在臨床治療中有一定的副作用，如腎毒性［1，16］。臨床上通過水合作用減少腎毒性，但是仍有超過1/4患者出現腎功能障礙，繼而進展為急性腎損傷，甚至腎功能衰竭［17］。因此，探討順鉑引起腎損傷機制，可為減輕化療患者不良發應提供相應策略。本實驗中，順鉑誘導后，腎功能及腎臟病理提示順鉑導致實驗小鼠腎損傷，并且FcγRIIB缺失時癥狀更嚴重。同時觀察到腎組織相關巨噬細胞趨化因子和炎性因子升高，以及巨噬細胞活化等變化，提示FcγRIIB可通過促進巨噬細胞浸潤活化而導致急性腎損傷病情的進展。FcγRIIB通過其特有的ITIM結構傳遞抑制性信號，抑制PIP3活性，可引起細胞膜離子流變化，從而改變效應細胞功能狀態，如抑制細胞活化作用，減少抗體及炎性因子生成等［18－19］。

圖3 各組小鼠腎組織巨噬細胞浸潤及亞型Fig.3 The effect of FcγRIIB loss on macrophage infiltration and subtypes in renal tissues

圖4 各組小鼠腎組織CCL2、CCL3、CCL4 mRNA表達Fig.4 The effect of FcγRIIB loss on mRNA levels of CCL2，CCL3 and CCL4 in kidney tissues

巨噬細胞是免疫應答中的重要細胞，在固有性免疫和獲得性免疫中均發揮重要作用，參與多種病理生理過程，如急性腎損傷［20］。CCL2是腎損傷后募集巨噬細胞遷往損傷組織的重要趨化因子［6］。組織發生損傷時，CCL2通過介導骨髓釋放單核細胞，在細胞生成的多糖－蛋白質復合物濃度梯度下，引導單核細胞到達損傷組織［21］。在膜性腎病、IgA腎病、腎小球硬化癥中可見 CCL2含量增高［21］。本實驗發現AKI小鼠腎組織勻漿CCL2含量增加，而且FcγRIIB缺失時增加更為明顯。研究表明，給予順鉑的小鼠模型中可見腎臟巨噬細胞增多［22］，這與本實驗中模型鼠腎臟組織中出現CD68+巨噬細胞浸潤相一致，同時可見FcγRIIB－/－模型鼠CD68+巨噬細胞浸潤較WT模型鼠更多，這可能與FcγRIIB－/－模型鼠腎組織勻漿CCL2更高的表達量有關。

炎性因子的活化在順鉑誘導的急性腎損傷中其起重要作用［8］，單核細胞效應趨化因子 CCL3、CCL4是由激活的單核細胞分泌產生，以吸引其他免疫炎性細胞進入損傷組織［23］。本實驗中可見模型組腎組織CCL3、CCL4相對表達量高于對照組，在FcγRIIB－/－模型鼠更為明顯。TNF-α在急性腎損傷中扮演重要角色，TNF-α不僅可導致腎小管上皮損傷［24］，而且可促進其他炎性因子和趨化因子，如IL-1β、MCP-1表達，從而使更多炎細胞遷移到損傷腎組織中［8］。本研究結果可見模型組腎臟組織勻漿中 TNF-α 明顯高于對照組，且 FcγRIIB－/－模型鼠明顯且高于WT模型組，炎性因子以及趨化因子高表達可能是造成FcγRIIB－/－模型鼠腎損傷癥狀更嚴重的原因之一。

有研究表明，缺乏PI3K小鼠在腎損傷時可誘導巨噬細胞極化為M1類細胞，從而加重病情進展［4］。本研究在腎臟巨噬細胞分選檢測結果提示，M1類細胞在AKI組略增多，且FcγRIIB缺失時增多趨勢更明顯，而M2類巨噬細胞表達無明顯差異。這表明FcγRIIB－/－在順鉑誘導急性腎損傷中可能通過誘導巨噬細胞向M1類型極化而加重病情。

綜上所述，巨噬細胞參與順鉑引起的的腎損傷的發展，FcγRIIB可能通過抑制細胞因子及趨化因子的產生，減少巨噬細胞向M1類巨噬細胞極化的趨勢，從而減輕順鉑引起的腎損傷進展。但本研究主要集中于FcγRIIB對順鉑引起急性腎損傷中巨噬細胞的影響，其他炎細胞(如中性粒細胞等)可能也不同程度參與疾病過程，將下一步研究。