FcγRIIB缺失加重順鉑誘導小鼠的急性腎損傷*＊

金筱茜，吳通前，馬 嵐，鐘 沁，周 玲，高 健，袁 銳，余 芳，＊＊＊

(1.貴州醫科大學臨床微生物及免疫學教研室，貴州貴陽 550004;2.貴州醫科大學附院臨床研究中心，貴州 貴陽 550004;3.貴州醫科大學附院臨床檢驗中心，貴州貴陽 550004)

急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)的死亡率較高，會增加慢性腎病風險和住院時間［1］，全球每5名住院患者中就有1人受到AKI影響［2］。在住院患者中，成人AKI相關死亡率為24%，兒童為14%［3］;在重癥監護病房，AKI的發生率為50% ～70%，死亡率大于50%［2］。有研究表明，炎癥機制參與順鉑引起 AKI［4］。免疫反應中可與 IgA、IgE、IgD、IgM和IgG免疫球蛋白結合的受體統稱為FcRs，屬于免疫球蛋白家族的一份子，是細胞膜表面的糖蛋白，可結合抗體，連接固有及適應性免疫反應中細胞(中性粒細胞、肥大細胞、巨噬細胞和B細胞等)效應區域，幫助細胞識別病原及微生物［5］，并誘導相應效應。FcγR 即 IgG Fc段受體，人和靈長類動物只有 FcγRI、FcγRII、FcγRIII 三個亞群，而小鼠有 FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRRIII(CD16)、FcγRIV 四個亞群［6］，因其結構不同而具有不同功能。表達FcγRIIB細胞的胞漿區的受體為免疫受體酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs，ITIM)，在發生磷酸化后可抑制B淋巴細胞活化及增殖等傳遞抑制性信號［7－8］，參與一系列炎性疾病(自身免疫反應和感染性疾病)過程［9］。在腎小球腎炎模型中，老年鼠FcγRIIB受體表達較低，癥狀較中年鼠輕［10］。炎性組織中炎性細胞表面的FcγRIIB表達增高，這有助于在免疫效應階段增高免疫反應細胞活性閾值以應對炎性反應［11］。而另一些研究表明，缺乏FcγRIIB小鼠在分支桿菌感染時會分泌更多的IL-12提高感染抗性［12］。FcγRIIB作為唯一抑制性受體，雖然已知其與炎癥反應有關，但是它在AKI中的作用還不明確，因此本研究通過順鉑誘導FcγRIIB野生型小鼠及FcγRIIB基因敲除小鼠AKI，探究FcγRIIB在AKI中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 野生型(FcγRIIB+/+)C57BL/6小鼠購自北京華富康生物科技有限公司，FcγRIIB基因敲除(FcγRIIB－/－)C57BL/6小鼠由哥德堡大學MIVAC醫學實驗動物中心贈予。所有實驗均使用8～10周雄性小鼠，并于特定無病原體的實驗室飼養，動物實驗方案經貴州醫科大學動物保護委員會批準并實施(證號1503057)。

目前國內有關運費險的研究在針對消費者購買運費險的具體決策過程和心理刻畫方面相對不足，因此可將消費者在面對商家是否提供運費險時的決策過程作為繼續研究運費險問題的新切入點。

1.1.2 主要試劑及儀器 順鉑(美國Sigma公司)，血清肌酐(Scr)試劑盒(南京建成生物有限公司)，血清尿素氮(BUN)試劑盒(南京建成生物有限公司)，酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(武漢華美)，多聚甲醛(美國Sigma公司)。組織脫水機(德國萊卡)，石蠟包埋機(德國徠卡)，手動切片機(德國徠卡)，冷凍離心機(美國賽默飛世爾公司)，光學顯微鏡(德國徠卡)。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組及給藥 隨機將FcγRIIB+/+小鼠和 FcγRIIB-/－小鼠分為 FcγRIIB+/+對照組，FcγRIIB+/+AKI 模 型 組，FcγRIIB－/－對 照 組，FcγRIIB－/－AKI模型組，每組5 只小鼠。模型組按照20 mg/kg體質量腹腔注射順鉑，對照組腹腔注射等量生理鹽水。

HE染色可見，FcγRIIB+/+AKI模型組及FcγRIIB－/－AKI模型組小鼠腎小管上皮腫脹、刷狀緣脫落，炎性細胞浸潤，腎小球形態大致正常;FcγRIIB－/－AKI模型組小鼠較 FcγRIIB+/+AKI模型組小鼠腎小管壞死癥狀更嚴重。FcγRIIB+/+對照組及FcγRIIB－/－對照組小鼠腎臟組織結構形態大致正常。與 FcγRIIB+/+對照組及 FcγRIIB－/－對照組相比，AKI組ATN評分明顯升高，差異有統計學意義(P＜0.01);FcγRIIB－/－AKI模型組小鼠較FcγRIIB+/+AKI模型組小鼠ATN分值更高，差異有統計學意義(P＜0.01)。見圖2。

1.3 統計學方法

尤為重要的是，改編經典科普巨著的難度較大，而這些作者們在寫作中進行了創新性解讀，得到了同行專家學者的賞激。兒童文學作家、首都師范大學教授金波老師認為這是中國當代第一套專門寫給少年兒童的經典文庫作品；中科院院士許智宏，地理學家、中國科學院院士陸大道，中國科學院院士周忠和，著名科普作家葉永烈，中國工程院院士、中國醫學科學院藥用植物研究所名譽所長肖培根等學者都對這套文庫贊賞不已，并作序推薦給少年兒童。

2 結果

2.1 一般情況

與 FcγRIIB+/+對照組及 FcγRIIB－/－對照組比較，FcγRIIB+/+AKI模型組及 FcγRIIB－/－AKI模型組腎臟組織勻漿TNF-α及IL-6含量均升高(P＜0.05)，FcγRIIB－/－AKI模型組增加更為明顯，差異有統計學意義(P＜0.01);而IL-10含量降低，在FcγRIIB－/－AKI模型組降低更為明顯，差異有統計學意義(P＜0.01)。見圖1。

對教師進行了問卷調查，并進行整理、分析，得出結論。教師團隊目前學歷分布情況是：研究生約占3%、本科約占70%、專科約占26.7%。教師隊伍有扎實的知識積累，樂于學習、樂于思考、有干勁和熱情，但對教育理論向教學實踐方面的轉化還有些滯后，部分教師的教學方法和策略還有待提高。

2.2 血清Scr和BUN

氣瓶充裝站原料儲罐介質具有令人窒息、易燃、易爆、腐蝕等危險性質，一旦發生安全事故，人員無法有效靠近。GB/T 18442.6—2011《固定式真空絕熱深冷壓力容器第6部分：安全防護》和GB 50160—2008《石油化工企業設計防火規范》對遠程緊急切斷系統具有嚴格的要求。

使用GraphPad Prism6軟件分析數據，計量數據以均數±標準差(±s)表示，兩個獨立樣本組間比較用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

表1 各組小鼠血清Scr及BUN水平(x±s，mg/L)Tab.1 Serun levels of Scr，BUN in each group

2.3 腎臟組織勻漿TNF-α、IL-6及IL-10表達水平

實驗期間，模型組小鼠活動減少，精神萎靡，進食減少，體毛光澤欠佳，對照組小鼠活動良好，精神以及進食正常。

與 FcγRIIB+/+對照組及 FcγRIIB－/－對照組比較，FcγRIIB+/+AKI模型組及 FcγRIIB－/－AKI模型組小鼠Scr和BUN明顯升高，差異有統計學意義(P＜0.01);與 FcγRIIB+/+AKI模型組比較，FcγRIIB－/－AKI模型組小鼠Scr和BUN 顯著升高，差異有統計學意義(P＜0.01)。見表1。

圖1 各組小鼠腎臟組織勻漿TNF-α，IL-6和IL-10表達水平Fig.1 Levels of TNF-α，IL-6 and IL-10 in kidney homogenate

2.4 腎臟組織學改變

1.2.2 觀測指標 注射72 h后，收集各組小鼠腋動脈血，分離血清檢測血清Scr和BUN;之后吸入麻醉處死小鼠，取雙側腎臟;左腎后按照試劑盒說明，冰上電動研磨成組織勻漿，ELISA法檢測TNF-α、IL-6及IL-10表達水平。分離小鼠右腎，用4%多聚甲醛水溶液固定，石蠟包埋，切片3μm厚，蘇木素－伊紅(HE)染色，光學顯微鏡下觀察腎組織;腎損傷以腎小管上皮腫脹、刷狀緣脫落、空泡變性為基礎，采用半定量評分法，每張切片(200×)取相同組織結構部位隨機10個視野，0分表示損傷面積＜10%，1、2、3和4分則分別表示損傷面積為10% ～＜25%、25～ ＜50%、50～ ＜75%、≥ 75%;評分后計算其平均值，評估腎小管壞死(ATN)程度［13］。

3 討論

腎功能可通過血肌酐、血尿素氮水平及組織病理學反映。本實驗模型組小鼠血清Scr及BUN明顯升高，病理組織明顯改變，說明AKI模型成功。實驗結果顯示 FcγRIIB－/－模型組小鼠血清 BUN及Scr，腎臟病理損傷以及組織炎性因子高于野生型小鼠，說明FcγRIIB在順鉑誘導的AKI中可能抑制病情的發展。

順鉑腎毒性的特點是可激活促炎細胞因子。細胞因子TNF-α在順鉑誘導腎損傷中發揮重要作用，抑制TNF-α釋放或活性可減輕順鉑腎毒性，這與TNF-α可能導致腎上皮細胞損傷有關［14］。順鉑誘導AKI隨腎臟IL-6產生增多而加重［15］。順鉑誘導的腎損傷包括腎小管細胞DNA碎裂，腫瘤抑制蛋白P53、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)以及白介素6(IL-6)水平升高［16］。因此腎臟炎癥以及炎性因子的表達在AKI中起至關重要的角色。

圖2 各組小鼠腎臟組織學(HE，×200)Fig.2 Kidney injury condition of mice in each group

FcγRIIB是人類和小鼠體內唯一的抑制性受體，通過胞質區域中含有的基于酪氨酸免疫抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM)傳遞抑制信號［17－18］。研究表明，在真菌感染 FcγRIIB－/－小鼠體內血清炎性因子 TNF-α 和IL-6水平高于野生型小鼠，以對抗 FcγRIIB－/－小鼠體內更高的載菌量［19］。這與本研究中，順鉑誘導的腎損傷，組織勻漿促炎子性因子TNF-α和IL-6升高相一致，而抗炎性細胞因子IL-10呈現下降趨勢，而且在FcγRIIB－/－小鼠中下降趨勢更明顯。白細胞介素-10(IL-10)是一種具有抗炎特性的細胞因子，通過限制病原體的免疫反應從而防止對宿主的損害，在炎性及感染過程中發揮核心作用［20］。橘皮素可通過下調TNF-α以及上調IL-10減輕順鉑毒性［21］。在真菌感染小鼠體內，血清IL-10水平下降［19］。FcγRIIB 通過 ITIM 傳導抑制信號時，可形成SH2識別結構域，繼而招募包含SH2的肌醇磷酸酶(SHIP)等分子，在通過PI3K將3，4，5磷脂酰肌醇三磷酸(PIP3)水解為4，5磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)［22］，此脫磷酸過程可抑制PIP3聚集含有PH(pleckstrin homology)結構域蛋白，比如磷脂酶Cγ(PLCγ)，可使其聚集到細胞膜，引起膜離子膜離子通道改變，減少鈣離子內流，從而抑制相關激酶參與的細胞活化效應，加強吞噬作用、減少細胞因子或抗體的產生等［8］。因此 FcγRIIB－/－小鼠對炎癥誘導表現出更高反應性，組織病理損傷更嚴重，高水平促炎因子和低水平抑炎因子加重AKI的進程。

綜上所述，本實驗通過順鉑誘導建立AKI模型，觀察到FcγRIIB可能對AKI病程起保護作用，這為臨床治療AKI提供了新的靶點，但是FcγRIIB參與AKI過程涉及的細胞或者效應蛋白分子，以及在人類中是否同樣具有抑制順鉑誘導AKI病程的作用，仍需要進一步研究。