漢防己堿衍生物誘導人乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡*＊

黃晏軍，湯長寧，楊 爽，潘衛東，劉杰麟＊

(1.貴州醫科大學免疫學教研室，貴州貴陽 550004;2.貴州醫科大學組織工程與干細胞中心，貴州貴陽 550004;3.貴州省天然產物化學重點實驗室，貴州貴陽 550004)

乳腺癌是女性常見惡性腫瘤，占女性惡性腫瘤發病率的29%，其中三陰性乳腺癌是不表達雌激素受體、人表皮生長因子受體-2(HER2)和孕激素受體的惡性腫瘤，該類乳腺癌治療預后差、復發轉移率高、死亡率較高，已成為近年來科研學者研究的焦點。由于三陰性乳腺癌患者缺少相應受體的表達，因此患者無法從針對乳腺癌的靶向治療中獲益。化療是目前較常用的治療方法，許多新型的化療藥物也正在研究之中［1－2］。漢防己堿又名漢防己甲素，屬于雙芐基易喹啉類生物堿，是一種由粉防己的根部提取的中藥成分，早期的研究表明漢防己堿具有抗感染，鎮痛等多種臨床功效，臨床用于治療心血管疾病、矽肺和免疫性疾病等［3］。除此之外，漢防己堿衍生物的功效也在研發探索過程中，部分衍生物在抑制腫瘤細胞生長方面有良好的效果。BLM解旋酶參與了DNA復制、重組、損傷修復等一系列過程［4］。乳腺癌易感基因1(BRCA1)主要參與了DNA損傷修復信號通路的調節［5］。課題組前期研究發現漢防己堿衍生物能夠調節DNA損傷修復信號通路，抑制乳腺癌細胞的生長，如漢防己堿衍生物P-42、漢防己堿衍生物HL-42和漢防己堿衍生物HL-49均能誘導人乳腺癌細胞凋亡，其機制可能與DNA損傷修復相關蛋白表達有關［6－7］。本文將探討漢防己堿衍生物YZ-18對MDAMB-231細胞增殖和誘導的影響，并探討其誘導凋亡的機制，以尋找藥物治療三陰性乳腺癌的新途徑，為新型抗腫瘤藥物的研制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

漢防己堿衍生物YZ-18由貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室提供。DMEM高糖培養液購自HyClone公司，細胞培養用的胎牛血清購自天杭生物科技公司，MTT試劑購自索萊寶科技公司，細胞凋亡檢測試劑盒(Annexin V-FITC/PI雙染)購自天根生化科技公司，一抗(兔抗人β-actin單克隆抗體、BLM多克隆抗體、BRCA1多克隆抗體)以及二抗(辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔抗體)購自博奧森生物技術公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 TNBC MDA-MB-231細胞保存在貴州醫科大學組織工程與干細胞研究中心，使用含有10%胎牛血清、1%雙抗(100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素)的高糖DMEM培養液，在37℃、5%CO2的恒溫培養箱中進行培養。

1.2.2 MDA-MB-231細胞增殖檢測 采用MTT法檢測MDA-MB-231細胞增殖情況。取對數生長期的MDA-MB-231細胞接種于96孔板(按照每孔2.5×104個細胞)，待細胞貼壁生長后，分別加入不同濃度的漢防己堿衍生物YZ-18作用細胞(藥物終濃度為0、0.5、1、2、4、8、16 μmol/L)。分別培養1、2和3 d后，每孔加入MTT溶液(5 g/L)20μL，于培養箱中孵育4 h，棄上清液后，每孔加入 DMSO 150μL溶解結晶，采用酶標儀測定各藥物處理組吸光度(OD值)，每組設3個復孔，實驗獨立重復3次，并計算各藥物處理組細胞的增殖抑制率［細胞增殖抑制率=(對照組OD－實驗組OD)/對照組OD)×100%］，并計算不同濃度漢防己堿衍生物YZ-18作用不同時間的半數抑制濃度(IC50)值。

1.2.3 MDA-MB-231細胞克隆形成能力檢測 集落形成實驗檢測MDA-MB-231細胞克隆形成能力。取對數生長期的MDA-MB-231細胞接種于24孔板(按照每孔3×102個細胞)，待細胞貼壁生長后，分別加入不同濃度的漢防己堿衍生物YZ-18作用細胞(終濃度為 0、0.25、0.5、1、2.5、5 μmol/L)。藥物作用2 d后換為正常培養液繼續培養。7 d后終止培養，棄上清液后，甲醇溶液固定細胞，行Giemsa染色，倒置顯微鏡下觀察集落生長情況，每組設3個復孔，實驗獨立重復3次，并計算各藥物處理組細胞集落形成數目。

1.2.4 MDA-MB-231細胞的凋亡檢測 流式細胞術檢測MDA-MB-231細胞的凋亡情況。取對數生長期的MDA-MB-231細胞接種于6孔板(按照每孔2×105個細胞)，待細胞貼壁生長后，分別加入不同濃度的漢防己堿衍生物YZ-18作用細胞(終濃度為0、1、8μmol/L)。藥物作用2 d后，收集各藥物處理組細胞，先加入Annexin V-FITC染色液避光染色后，再加入PI染色液避光染色，染色后立即用流式細胞儀檢測各組的凋亡率，每組設3個復孔，實驗獨立重復3次。

1.2.5 MDA-MB-231細胞中BLM、BRCA1蛋白表達水平檢測 Western blot法檢測MDA-MB-231細胞BLM、BRCA1蛋白表達水平。漢防己堿衍生物YZ-18作用后取對數生長期的MDA-MB-231細胞接種于6孔板(按照每孔2×105個細胞)，待細胞貼壁生長后，分別加入不同濃度的漢防己堿衍生物YZ-18作用細胞(終濃度為0、1、8μmol/L)。作用2 d后，收集各藥物處理組細胞，裂解液冰上裂解細胞，提取總蛋白，并測定蛋白濃度。經 SDSPAGE電泳后濕法轉膜，與兔抗人 β-actin、BLM、BRCA1抗體4℃孵育過夜，與二抗(辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔抗體)37℃孵育2 h，加入 ECL化學發光試劑后立即使用化學發光儀檢測蛋白條帶，每組設3個復孔，實驗獨立重復3次。

1.3 統計學方法

以上實驗均獨立重復3次。應用SPSS 17.0統計軟件對實驗數據進行統計分析，計量資料多組間比較采用方差分析，組內比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 漢防己堿衍生物YZ-18可抑制MDA-MB-231細胞的增殖活性

分別用不同濃度的漢防己堿衍生物YZ-18作用MDA-MB-231細胞1、2和3 d后，通過MTT法檢測細胞的增殖活性。結果顯示，與對照組相比，用不同濃度的漢防己堿衍生物YZ-18(藥物終濃度為 0.5、1、2、4、8、16 μmol/L)作用 MDA-MB-231 細胞1、2和3 d后均能抑制細胞的增殖(P＜0.05)，且呈現藥物濃度和處理時間依賴性，見圖1。YZ-18作用MDA-MB-231細胞24、48、72h的IC50值分別為(3.89 ±0.27)、(2.97 ±0.34)、(1.59 ±0.13)μmol/L。

圖1 YZ-18對MDA-MB-231細胞增殖的影響Fig.1 The effect of YZ-18 on the proliferation of MDA-MB-231 cells by MTT assay

2.2 漢防己堿衍生物YZ-18可抑制MDA-MB-231細胞的克隆形成能力

分別用不同濃度的漢防己堿衍生物YZ-18作用細胞2 d，繼續培養1周后，通過平板集落形成實驗檢測各藥物濃度組MDA-MB-231細胞的集落形成數量。結果顯示，與對照組相比，不同濃度的漢防己堿衍生物YZ-18(藥物終濃度為0.25、0.5、1、2.5μmol/L)干預MDA-MB-231細胞后，各藥物作用組集落數量均明顯減少(P＜0.001)，且呈現出藥物濃度依賴性。見圖2。

圖2 YZ-18對MDA-MB-231細胞克隆形成能力的影響(Giemsa，×400)Fig.2 The effect of YZ-18 on clone formation of MDA-MB-231 cells was detected by plate clone formation assay

2.3 漢防己堿衍生物YZ-18可促進MDA-MB-231細胞的凋亡

分別用不同濃度的漢防己堿衍生物YZ-18作用MDA-MB-231細胞2 d后，采用流式細胞儀觀察各藥物濃度組細胞的凋亡情況。結果顯示，與對照組相比，不同濃度的漢防己堿衍生物YZ-18(藥物終濃度為1和8μmol/L)干預MDA-MB-231細胞后，各藥物濃度處理組MDA-MB-231細胞的凋亡率均明顯高于對照組(P＜0.01)。且呈現藥物濃度依賴性。見圖3。

圖3 YZ-18對MDA-MB-231細胞凋亡的影響Fig.3 The effect of YZ-18 on apoptosis of MDA-MB-231 cells

2.4 漢防己堿衍生物YZ-18對MDA-MB-231細胞中BLM、BRCA1蛋白表達水平的影響

分別用不同濃度的漢防己堿衍生物YZ-18作用MDA-MB-231細胞2 d后，采用Western blot法檢測各藥物濃度組 MDA-MB-231細胞中 BLM、BRCA1蛋白表達情況。結果顯示，與對照組相比，不同濃度的漢防己堿衍生物YZ-18(藥物終濃度為1和8μmol/L)干預MDA-MB-231細胞后，細胞中BLM蛋白表達上調，BRCA1蛋白表達下調，且呈現藥物濃度依賴性。見圖4。

圖4 YZ-18對MDA-MB-231細胞中BLM、BRCA1蛋白表達水平的影響Fig.4 The effect of YZ-18 on protein expression of BLM，BRCA1 in MDA-MB-231 cells

3 討論

漢防己堿作為傳統的中藥成分，目前臨床上主要用于抗感染、鎮痛、控制血壓等［3］，大量研究表明，漢防己堿可以作為腫瘤化學療法的一個潛在藥物，漢防己堿能夠抑制胃癌、結直腸癌、等多種惡性腫瘤細胞的生長，也陸續報道了在誘導細胞凋亡方面的部分作用機制。有探索發現，漢防己堿能夠抑制結腸癌細胞異種移植后的生長［8］，通過激活胞內線粒體中Caspase相關蛋白途徑來誘導胃癌細胞的凋亡［9］，發現漢防己堿可以作為細胞膜Ca2+通道阻斷劑和Ca2+通道拮抗劑來抑制腫瘤生長［10］。漢防己堿可誘導成纖維細胞的凋亡，與此同時，在TGF-β引導心臟成纖維細胞激活的過程中，它還可以阻斷其激活途徑［11］。Tian 等［12］在研究漢防己堿干預人骨肉瘤細胞的增殖時發現漢防己堿主要是通過上調PTEN通路起作用。在研究漢防己堿誘導結腸癌細胞的凋亡時，He等［13］發現其機制可能與其調節Wnt/β-catenin信號通路有關，Chen等［14］發現可能與其調節 PI3K/Akt信號通路轉導進而誘導結腸癌細胞凋亡。Zhang等［15］發現它在肝細胞癌體內轉移方面起著關鍵的作用，可以干預細胞的轉移。

本實驗通過MTT實驗檢測發現，用1、2、4、8、16μmol/L漢防己堿衍生物YZ-18干預MDA-MB-231細胞1、2和3 d后均能抑制細胞的增殖(P＜0.05)。呈現藥物濃度和處理時間依賴性。集落形成實驗結果表明，漢防己堿衍生物YZ-18干預MDA-MB-231細胞2 d后，繼續常規培養時細胞克隆形成能力明顯減弱，且抑制效應呈現處理濃度依賴性。通過流式細胞術檢測發現，漢防己堿衍生物YZ-18干預細胞后，可促進細胞的凋亡，且凋亡效應依賴藥物濃度。以上實驗結果表明，YZ-18能夠有效抑制人三陰性乳腺癌細胞的生長，并誘導其凋亡。為了深入探討YZ-18干預抑制MDA-MB-231細胞增殖的可能機制，本實驗繼續檢測了BLM蛋白和BRCA1蛋白的表達。

DNA損傷普遍存在于真核細胞中，紫外線照射、電離輻射以及化學制劑等各種因素均能導致DNA損傷，其中最嚴重的是DNA雙鏈斷裂(DSB)。發生DSB后可引起細胞凋亡、細胞周期阻滯，此時胞內DNA損傷修復應答開始發揮作用［16］。人類RecQ DNA解旋酶家族中有 RECQ1、BLM、WRN、RECQ4和RECQ5等5種RecQ解旋酶，主要是維持細胞基因組的穩定［4］。BLM蛋白作為細胞內重要的DNA損傷修復酶，當基因因外力因素導致DNA雙鏈發生損傷時，可以通過代償性表達BLM解旋酶來發揮DNA損傷修復功能［17］。BRCA1作為DNA損傷修復信號通路的重要調節蛋白，能夠維持基因組的穩定，主要是通過激活DNA損傷修復的調控點起作用［18］。比如在同源重組修復過程中，主要是通過以BRCA1為中心的復合物感知DNA損傷，繼而引導同源重組修復的關鍵酶(Rad51)啟動同源重組途徑，對損傷的DNA進行修復［19］。除此之外，BLM 解旋酶、拓撲異構酶IIIα、RecQ介導的基因組不穩定蛋白1(RMI1)和RecQ介導的基因組不穩定蛋白2(RMI2)可以形成BTR復合物，該復合物與Rad51、BRCA1相互作用進而在同源重組修復過程中分解dHJ，修復DNA雙鏈斷裂［20］。總之，BLM蛋白和BRCA1蛋白均與DNA損傷修復有關。本實驗發現，YZ-18干預乳腺癌MDA-MB-231細胞后，細胞中BLM蛋白表達量明顯高于對照組，BRCA1蛋白明顯低于對照組，表達水平明顯依賴藥物濃度。據以上實驗數據推測，可能是由于漢防己堿衍生物YZ-18處理細胞后導致了胞內DNA的損傷，進而誘導DNA損傷修復應答，BLM蛋白通過表達上調，BRCA1蛋白通過表達下調，參與DNA損傷修復應答，同時引導相關凋亡信號的激活，引起細胞凋亡，抑制細胞增殖。

綜上，本次實驗發現漢防己堿衍生物YZ-18干預后，乳腺癌MDA-MB-231細胞的增殖和集落形成能力均受到抑制，凋亡率增加。推測可能的機制是，漢防己堿衍生物YZ-18可以通過調節DNA損傷修復通路途徑進而調控胞內凋亡信號通路的傳導。因此本實驗為漢防己堿衍生物YZ-18作為抗腫瘤新藥的研發應用提供了可靠的研究證據。