JLN綜合征中國家系研究新發現的KCNE1基因錯義突變

丁軒詣　丁旵東　楊二麗

【摘要】 目的：對伴發室性心律失常電風暴的Jervell-Lange-Nielsen綜合征（JLNS）（先天性QT間期延長綜合征伴先天性耳聾亞型）一家系進行基因突變檢測，以期發現中國人特有的基因突變。方法：采用聚合酶鏈反應（PCR）及DNA直接測序法對JLNS一家系進行KCNE1檢測。結果：先證者及7位家系成員的KCNE1基因的第112位外顯子發現一錯義突變：A→G，致絲氨酸密碼子（AGT）變成甘氨酸密碼子（GGT）。結論：JLNS可由KCNE1基因的突變引起，KCNE1基因第112位A→G錯義突變是首次發現的中國JLNS的突變基因及位點。

【關鍵詞】 QT延長綜合征； 基因； 突變

Newly Discovered Missense Mutation of KCNE1 Gene in Chinese Family Study of JLN Syndrome/DING Xuanyi，DING Chandong，YANG Erli，et al.//Medical Innovation of China，2018，15（03）：139-142

【Abstract】 Objective：To detected gene mutation in Chinese family with Jervell-Lange-Nielsen syndrome（JLNS） associated with electrical storm of ventricular arrhythmia（congenital long QT syndrome with congenital deafness subtype），in order to find a specific gene mutation in Chinese.Method：Polymerase chain reaction（PCR） and direct sequencing of DNA were used to detect KCNE1 in a family of JLNS.Result：A missense mutation was found in the 112nd exons of the KCNE1 gene of the proband and 7 members of family：A→G，causing serine codon（AGT） to turn into glycine codon（GGT）.Novel heterozygous mutation in the exon 112 of KCNE1 was identified in proband and 7 of 9 her relatives，nucleotide A was replaced by G，which led to change of amino acid.Conclusion：JLNS can be caused by the mutation of the KCNE1 gene，and the A to G missense mutation of the 112nd gene of the KCNE1 gene is the first found mutation gene and site of the Chinese JLNS.

【Key words】 Long QT syndrome； Genes； Mutation

First-authors address：Hefei No.1 Middle School，Hefei 230601，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.03.038

先天性QT間期延長綜合征（long QT syndrome，LQTS）是一種家族遺傳性疾病，臨床表現為QTc間期異常延長、反復發作致命性心律失常導致暈厥甚至猝死，同時伴有或不伴有先天性耳聾，并且稱伴有先天性耳聾的為Jervell-Lange-Nielsen綜合征（JLNS），不伴先天性耳聾的稱Romano-Ward綜合征（RWS）。其中，JLNS是較RWS更為罕見的類型[發病率（1～6）∶1 000 000]，JLNS患者發生暈厥和猝死等惡性事件的概率也更高[1-2]。由于JLNS是罕發疾病，目前國內外深入研究較少，國外先前研究發現JLNS發病與KCNQ1或KCNE1基因突變有關，但國內研究僅有KCNQ1基因突變的病例報道[3-5]。安徽醫科大學第二附屬醫院收住了一例發作室性心律失常電風暴（24 h內發生2次以上室性心動過速或心室顫動）的JLNS患者，急診消融觸發心室電風暴的室性早搏病灶，對患者及其家系成員進行了KCNE1基因檢測，以便能夠進一步推動對JLNS基因突變位點的發現?，F報道如下。

1 資料與方法

1.1 先證者及其家系臨床資料 先證者女性51歲，自幼耳聾，近年多次發生暈厥，入院后24 h內心電監護多次記錄到室性早搏觸發的尖端扭轉性室性心動過速甚至短暫心室顫動，可自行緩解，發作時患者意識喪失，四肢抽搐。發作間期心電圖（ECG）提示QTc>500 ms。耳鼻喉?？茩z查提示雙側極重度感音神經性耳聾。符合JLNS診斷：（1）先天性耳聾；（2）QTc>460 ms；（3）有暈厥史或尖端扭轉型室性心動過速/心室顫動的發作[6-10]。為降低猝死風險，急診在三維導航指引下行室性早搏觸發病灶的消融治療[11-16]。該家系來自中國安徽省，共3代、10人（含先證者），均進行ECG及相關臨床檢查。2例患有先天性聽力障礙（先證者及其兒）被診斷為JLNS。

1.2 血樣標本的收集與處理 首先抽取患者及其家庭成員的靜脈血2～5 mL，進行抗凝處理后冷藏在-70 ℃的冰柜中。

1.3 主要試劑 選擇Sigma公司生產的蛋白酶和biostar公司生產的聚合酶、DNTP，以及基因公司生產的試劑盒和試劑等。

1.4 基因組DNA的獲取 常規酚/氯仿提取白細胞基因組DNA。

1.5 基因組聚合酶鏈反應（PCR） （1）引物合成：PAGE方式合成KCNE1基因的3對引物[4]，由廣州廣譽生物科技有限公司合成，引物序列，見表1。（2）PCR擴增：使用高保真PCR酶KOD-Plus-Neo，以基因組DNA為模板配制以下反應體系（50 μL），見表2。PCR反應程序：94 ℃預變性

3 min，98 ℃變性10 s（循環30次），58 ℃退火30 s（循環30次），68 ℃延伸20 s（循環30次），68 ℃再延伸5 min[4]。

1.6 DNA測序 使用3700DNA測序儀對濃度為5 μmol/L的純化后的聚合酶反應物進行DNA正反雙向測序。為進一步驗證檢測結果的正確性，使用T-VECTOR對純化后的PCR產物導入DH5α感受態細胞，經過正反雙向檢測所提取的陽性克隆質粒發現，直接測序的結果與其相同。

1.7 突變位點的確定 對測序結果KCNE1 DNA全長使用Genebank blast軟件進行比對，以便其突變位點的進一步確定。同時經過在Human Mutation Database網站上的進一步確定其無新的突變產生。另選取10名普通人的DNA進行提取并進行KCNE1外顯子112的PCR擴增，經直接測序發現在普通人中無該突變點的存在[17]。

2 結果

（1）先證者在三維導航指引下急診行室性早搏觸發病灶消融治療后，住院期間心電監護及出院隨訪6個月均未再出現暈厥或惡性室性心律失常發作。（2）基因組DNA提取及PCR擴增結果，見圖1、2。（3）測序結果：家系成員除女兒和三舅孫女外其余8人都在KCNE1基因的第112位發生A→G的錯義突變，引起絲氨酸密碼子（AGT）改變成甘氨酸密碼子（GGT）。見圖3、4。

3 討論

JLNS1和JLNS2是目前確定的兩種類型的JLNS，其中KCNQ1基因和KCNE1基因分別為JLNS1型和JLNS2型的致病基因[18-19]。在以前的研究中普遍覺得JLNS是由于這兩種基因的結合和突變產生的，但經過前一段時間的研究發現，JLNS也可能會因為KCNQ1基因的復雜的雜合突變而產生，患者的體內會產生來自于父方和母方兩個方面的雜合突變，這兩種突變同時產生并發揮作用[6-7]。本研究結果顯示，該家系成員除女兒及三舅孫女外的KCNE1基因第112位外顯子發生A→G的錯義突變，致AGT變成GGT，使編碼的絲氨酸被甘氨酸所代替。按照上述致病基因分型，本研究的先證者系JLNS2型患者。JLNS2型是否也存在雜合突變，目前尚沒有報道。本研究初步結果表明，JLNS2型也可以只是KCNE1基因的雜合突變，至于是否合并有其他基因的雜合突變有待于后續研究進一步證實。

KCNE1基因又稱minK，由Murai在1989年最先報道，基因定位于21q22.1-22.2，長約40 bp，有三個外顯子，其中兩個位于5-UTR，該基因編碼的minK由129個氨基酸殘基組成，分為胞外區、跨膜區、胞漿區三個部位組成，只有一個跨膜結構，其中胞外區、跨膜區均為小片段。KCNE1基因主要在多種人體組織及外周血白細胞中表達。minK起主要作用機制是輔助α-亞基和β-亞基組成復合離子門控通道，并通過調節α-亞基門控，增強復合離子通道的穩定性。KCNE1在異源表達系統中產生的電流動力學特征與慢速激活鉀通道電流（IKs）相似，且心臟各處均有KCNE1的表達，心臟電流由KCNE1蛋白異源多聚體所介導，KCNE1異常可引起惡性室性心律失常的發生，臨床表現反復暈厥甚至猝死[8-10]。

而先天性神經性耳聾，則是JLNS和RWS區別的重要表現。造成耳聾的機制為：KCNQ1或KCNE1基因在內耳的血管紋狀細胞中發生基因異常突變從而產生異常的亞單位，導致淋巴系統分泌紊亂和耳蝸中室的塌陷，從而引起耳聾的發生[11-12]。本研究結果顯示，先證者KCNE1基因突變A→G錯義突變，使編碼的AGT被GGT所代替，產生結構功能異常的亞單位，是產生先天性耳聾的基礎。

Russell等[13]發現，JLNS型LQTS并沒有完全遵循隱性遺傳的規律，其基因攜帶者表現出常染色體顯性遺傳的特點，其QT間期輕、中度延長，并可有暈厥發作，但不伴有耳聾。本研究家系部分成員也存在KCNE1的錯義突變，但并沒有伴有先天性耳聾。為何出現相同的基因位點突變，只有部分家系成員呈現JLNS表型特征，是否呈現JLNS表型特征的成員還存在其他相關基因的突變，即存在幾個基因的復合的雜合突變，尚有很多未知的領域值得探討[20]。

綜上所述，JLNS可由KCNE1基因的突變引起，KCNE1基因第112位A→G錯義突變是首次發現的中國JLNS的突變基因及位點。

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（收稿日期：2017-12-15） （本文編輯：董悅）