分裂泛素化酵母雙雜交系統研究信息素因子STE2蛋白相互作用

劉小縵,王群,王石,高素素,王曉梅*

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分裂泛素化酵母雙雜交系統研究信息素因子STE2蛋白相互作用

劉小縵1,王群2,王石2,高素素2,王曉梅1*

1. 吉林農業大學農學院, 吉林 長春 130118 2. 山東農業大學植物保護學院;山東省蔬菜病蟲生物學省級重點實驗室, 山東 泰安 271018

真菌的進化、分化及有性發育趨勢受若干性別基因的調控，如交配型、信息素因子及異源三聚體G-蛋白-亞基基因等；同時，信息素因子調控真菌的有性生殖在釀酒酵母中也得到充分研究。匍柄霉屬()是絲狀子囊真菌中的一類重要真菌類群，許多絲狀子囊真菌屬、種中含有信息素因子。在自然界中，匍柄霉屬真菌大多數是以無性態的形式存在，但其中也有一小部分存在有性生殖階段。為了深入研究信息素受體STE2及其相關基因對匍柄霉屬典型種有性生殖的影響，本研究選取含有信息素因子STE2的匍柄霉屬典型種為試驗材料，克隆鑒定了信息素受體STE2，然后將其構建至誘餌蛋白表達載體上，并在cDNA文庫初篩得到數個疑似互作蛋白片段基礎上，克隆其基因全長構建至靶蛋白表達載體上，并利用分裂泛素化的膜酵母雙雜交系統，進行一對一驗證篩選STE2的相關互作蛋白。該研究篩選出的互作蛋白結果為后期的CO-IP、Poll-Down實驗提供了基礎。

信息素因子STE2; 匍柄霉屬; 分裂泛素酵母雙雜交; 互作蛋白

真菌的有性發育、分化及進化趨勢受若干性別基因的調控，主要包括異源三聚體G-蛋白-亞基基因、交配型基因（MAT）（MAT1-1-1基因和MAT1-2-1基因）、信息素因子（信息素前體基因和信息素受體基因），它們在真菌有性分化及發育過程中均發揮著重要的作用，而且相互協同構成一個復雜的性別調控系統[1]。匍柄霉屬（）為格孢腔菌（Pleospora）類群，由Wallroth于1833年以匍柄霉 (Wall.)為模式種建立的一種重要真菌屬[2]。在生物界中大部分絲孢真菌屬、種主要以無性型存在，而新西蘭匍柄霉()是在實驗室條件下能產生有性態的少數菌種之一，該種含有交配型基因和，是同宗配合真菌[3]。

絲狀子囊真菌含有信息素前體基因和信息素受體基因(Pheromones and pheromone receptors)，該類基因分別包括兩個信息素前體基因（a和）和兩個信息素受體基因（ste2和ste3），其中信息素受體基因（ste2和ste3）對性細胞識別、交配及交配后活動具有關鍵調控作用，可激活真菌異型細胞的有性生殖過程。研究發現，經過加工的信息素因子被a細胞表面的STE2受體識別，激活交配信號，啟動MAPK途徑，引發交配過程[4]；同樣，經過加工的信息素a因子被細胞表面的STE3受體識別[5]，執行同樣功能。所以，信息素及其受體對匍柄霉屬等真菌有性生殖有重要的影響。

蛋白質間相互作用的研究作為了解蛋白質生物功能的重要手段之一，在功能基因組學研究中起著重要的作用[6]。Fields等[7]發展的酵母雙雜交系統已被廣泛用于體內檢測蛋白質-蛋白質相互作用。據統計，目前已知的蛋白質相互作用至少有一半是通過酵母雙雜交技術發現的[8,9]但傳統的酵母雙雜交系統要求所檢測的生物分子必須同時定位在親水性的核基質中并具有功能結構，對于發生在細胞質中或細胞膜上的蛋白質間的相互作用將無法檢測[10]。為此，Stagljar等[11]在2002年發展了基于分裂泛素的膜酵母雙雜交系統。

膜酵母雙雜交系統基于分裂的泛素蛋白的重組，泛素是一類標記其他蛋白降解的小而高度保守的蛋白。泛素分子為76個氨基酸的肽鏈,并具有位于N端(Nub)及C端(Cub)的兩個相對獨立的結構域[12]，如果這兩部分在細胞中分開表達則他們都是部分折疊因此不能被泛素特異性蛋白酶(USPS)識別，如果Nub和Cub在同一細胞中共表達，兩個部分依靠彼此之間強烈的親和性，可以形成完整的泛素蛋白從而被USPS迅速識別并切割。分裂的野生型Nub(Nubl)和cub能通過擴散一碰撞模式重新自發折疊成具有生物活性的結構[12]。NubI突變為NubG后，分裂的NubG和Cub沒有親和力不能再以擴散一碰撞的模式重新折疊，因此可以利用這個特性將bait蛋白融合到泛素的Cub末端，并在Cub的N端或C端連接一個人工轉錄因子PLv(por一LeAx一VP16)，prey蛋白融合到泛素的N末端上；bait蛋白和prey相互作用時，使得兩者相互接近被融合的NubG和Cub重新折疊成完整泛素蛋白[11]被USPS識別切割，而釋放轉錄因子，轉錄因子轉移到細胞核上從而激活報告基因Hsi3和LacZ的表達[13]。

1 材料與方法

1.1 材料來源

分裂泛素化酵母雙雜交系統所用的誘餌蛋白載體PCCW-STE、靶蛋白載體pDSL-Nx、對照靶載體pAI-Alg5以及營養缺陷型酵母菌株NMY51由華中農業大學李一博老師惠贈。DH5大腸桿菌感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公司。限制性內切酶sfi Ⅰ購自Thermo science公司。YPDA、SD/-Leu、SD/-Trp、SD/-Leu/-Trp、SD/-His/-Leu/-Trp、SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp、3AT、酵母轉化試劑盒、鮭魚精DNA購自clontech。

1.2 方 法

1.2.1 STE2-PCCW-STE誘餌表達載體的構建以匍柄霉基因組DNA為模板，利用帶有sfiⅠ識別位點的特異性引物，PCR擴增帶有特異性序列的STE2片段。設計特異引物如下：

F：5′-GTAATGGCCATTACGGCCATGGAGGCCGAACCAATC‐3′，

R：5′-GATGGCCGAGGCGGCCTTCTGTTCATGCTCTTGTGC‐3′

PCR產物在1%的瓊脂糖凝膠中進行電泳，回收目的條帶，將回收產物用Sfi I酶切，分離酶切得到的目的片段和Sfi I酶切的PCCW-STE載體片段連接。連接產物轉化到大腸桿菌DH5感受態中，用Kana進行抗性篩選并進行PCR驗證，測序正確后提取質粒得到STE2-PCCW-STE載體。

1.2.2 構建完整靶蛋白基因的pDSL-Nx載體把用cDNA文庫初篩得到數個疑似互作蛋白片段與NCBI比對，得到的編號為01239、05727的全長核苷酸序列，并以匍柄霉基因組DNA為模板，利用帶有sfiⅠ識別位點的特異性引物PCR擴增得到01239、05727基因的全長核苷酸序列，將靶蛋白基因全長構建到pDSL-Nx載體上。用Amp進行抗性篩選并進行PCR驗證，測序正確后提取質粒得到01239-pDSL-Nx及05727-pDSL-Nx載體。

特異引物如下：

01239-pDSL-Nx-F：5’-CAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCATGGCCCTTGCTGGCCTCT-3’

01239-pDSL-Nx-R：5’-CGAATTCTCGAGAGGCCGAGGCGGCCGTTAGACAGAAGCGTACGCCT-3’

05727-pDSL-Nx-F：5’-CAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCATGGACGGAA AGGATAGCG-3’

05727-pDSL-Nx-R：5’-CGAATTCTCGAGAGGCCGAGGCGGCCGCTACGCCGGG GCAGGT-3’

1.2.3 PEG/LiAc法共轉酵母菌株NMY51用接種環挑取保存的適量NMY51酵母菌株，在2*YPDA固體培養基上劃線活化酵母，30 ℃培養箱中倒置培養3~4 d；待培養基上長出酵母菌落，挑取單個菌落于1 mL 2*YPDA液體培養基中重懸，并全部接種到含有50 mL 2*YPDA液體培養基的250 mL三角瓶中在30 ℃，250 rpm條件下的搖床中培養14~16 h，至OD600值為0.6~0.8；用1 mL離心管（只數大于所需轉化數）分裝后于12000 rpm、30 s離心收集菌體，棄凈上清；然后用1 mL滅菌水重懸洗滌菌體，12000 rpm、30 s離心收集菌體，棄上清；加入10 mg/mL的變性鮭魚精DNA，再分別加入500 ng共轉質粒（質粒組合：STE2-PCCW-STE/01239-pDSL-Nx、STE2-PCCW-STE/05727-pDSL-Nx、STE2-PCCW-STE/pDSL-Nx、PCCW-STE/01239-pDSL-Nx、PCCW-STE/05727-pDSL-Nx、STE2-PCCW-STE/PAI-ALG5）并用渦旋儀快速渦旋混勻；加入120 μL、50%的PEG 3350和17 μL的10×LiAc，用渦旋儀渦旋1 min后于42 ℃水浴鍋熱擊1 h（其間再渦旋1次），之后12000 rpm、30 s離心收集菌體，棄凈上清；用400 μL ddH2O重懸沉淀涂布在SD/-Leu/-Trp營養缺陷培養基上，30 ℃倒置培養3~4 d。

1.2.4 誘餌蛋白、靶蛋白的自激活鑒定在SD/-Trp/-Leu培養基上長出單菌落之后，分別挑取質粒組合為STE2-PCCW-STE/pDSL-Nx、STE2-PCCW-STE/01239（05727）-pDSL-Nx和PCCW-STE/01239（05727）-pDSL-Nx的單菌落分別點斑于含0、10、20、30、40、50、60、70、80和100 mmol L?13-氨基-1,2,4-三唑(3-AT)的三缺培養基(SD/-His/-Leu/-Trp)和四缺培養基（SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp）上，30 ℃培養3~4 d后觀察。

1.2.5 酵母雙雜交鑒定篩選誘餌蛋白、靶蛋白的自激活后，挑取單菌落分別點斑于SD/-His/-Leu/-Trp+3-AT、SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp+3-AT和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp /+ X-β-gal+3-AT固體培養基上，30 ℃暗培養4~6 d，記錄觀察結果。

由于靶蛋白載體pDSL-Nx上有編碼Trp的基因，誘餌蛋白載體PCCW-STE上有編碼Leu的基因，因此如果共轉化酵母成功，酵母能夠在營養缺陷型SD/-Leu/-Trp固體培養基上生長，用來檢驗共轉的轉化效率，而SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp培養基用來驗證與STE2互作的蛋白，如果某個基因表達的蛋白能夠與STE2發生互作，則與其分別融合的Cub和NubG就會相互靠近而重新組成完整的泛素蛋白，進而被UBPs識別，釋放轉錄因子VP16到細胞核中，啟動報告基因Ade2、His3，因而可以在營養缺陷型SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp培養基上生長；同時LacZ基因編碼β半乳糖苷酶，可以進行β半乳糖苷酶活性檢驗，陽性酵母克隆會表現為藍色，初步確定蛋白的互作。

2 結果與分析

2.1 信息素因子STE2的基因克隆及誘餌表達載體的構建

信息素受體STE2為7次跨膜蛋白，3個細胞內環和3個細胞外環連接7個跨膜結構域，整個蛋白質N端在細胞外，C端在細胞內。信息素因子STE2序列全長為1110 bp，編碼369個氨基酸，預測分子量42.33 kDa。克隆目的條帶在1000 bp略偏上處（圖1）。該基因用于構建融合載體STE2-PCCW-STE，并經PCR驗證。

圖 1 STE2基因PCR擴增結果

2.2 靶蛋白基因的克隆及pDSL-Nx載體構建

經NCBI網站中的blastn工具進行序列比對，選用匍柄霉基因組與篩選疑似序列核苷酸片段同源性最高的基因比對，得到的編號為01239（糖苷水解酶128蛋白）的序列全長為795 bp，編碼264個氨基酸，預測分子量28.94 kDa；05727（多元運輸蛋白5）的序列全長為1893 bp，編碼630個氨基酸，預測分子量69.81 kDa。其中01239克隆目的條帶在750 bp~1000 bp處（圖2-A），該基因用于構建融合載體01239-pDSL-Nx，并經PCR驗證；05727克隆目的條帶在接近2000 bp處（圖2-B），該基因用于構建融合載體05727-pDSL-Nx，并經PCR驗證。

圖 2 疑似互作蛋白基因PCR擴增結果

A：01239；B：05727

2.3 誘餌蛋白、靶蛋白的自激活鑒定

由于STE2-PCCW-STE2質粒不能和pDSL-Nx載體上的NubG重建，轉錄因子不被切離，不能激活酵母菌中的啟動子，因此二者共轉化的酵母菌不應該在三缺、四缺板上生長。但是His有一定程度的本底表達，因此需要用3-AT來抑制His的本底表達。在添加不同濃度3-AT的三缺培養基(SD/-His/-Leu/-Trp)和四缺培養基（SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp）上點斑培養來鑒定自激活活性。結果表明，誘餌蛋白存在自激活現象，只有在含50 mmol L-13-AT的三缺培養基上His本底表達被完全抑制，不能正常生長(圖3-A)；在含30 mmol·L-13-AT的四缺培養基上自激活被完全抑制，不能正常生長(圖3-B)，而陽性對照質粒能正常生長；同樣，01239與05727也存在自激活現象，只有在含70 mmol·L-13-AT的三缺培養基上、50 mmol·L-13-AT的四缺培養基上自激活被完全抑制，不能正常生長(圖3)。

圖 3 誘餌蛋白和靶蛋白自激活特性檢測及抑制His本底表達的3-AT濃度篩選

A：在三缺培養基(SD/-His/-Leu/-Trp)上點斑篩選培養 B：在四缺培養基（SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp）上點斑篩選培養

A: Spot culture of yeast NMY51 transformant on the SD/-His/-Leu/-Trp medium B: Spot culture of yeast NMY51 transformant on the SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp medium

2.4 酵母雙雜交初步鑒定

暗培養4~6 d后觀察發現轉化有空誘餌蛋白載體或空prey載體的不同質粒組合的陰性對照的酵母在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp+3-AT培養基上不能生長。發現基因號01239、05727及陽性對照可以在及SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp+3-AT培養基上正常生長，經-半乳糖苷酶活性進一步驗證，參照陽性對照發現轉化01239、05727靶蛋的酵母菌落明顯變為藍色，有較強地-半乳糖苷酶活性，而陰性對照不顯藍色(圖4)。初步確定01239和05727為與STE2互作的蛋白，可以進行下一步實驗確認。

圖 4 互作蛋白的驗證及β-半乳糖苷酶活性驗證

3 討論

本研究內容是通過膜系統酵母雙雜交方法，對信息素因子STE2的互作蛋白進行一對一驗證，得到了步驗證的與STE2互作的2個蛋白，一個是糖苷水解酶家族蛋白01239，另一個多元運輸類蛋白05727。目前，已有許多性別基因控制真菌有性生殖過程的研究，如在釀酒酵母中STE2、G蛋白等調控有性交配的過程。但是有關匍柄霉有性生殖的研究，特別是信息素及相關基因調控MAPK通路的研究少之又少。本研究初步驗證了STE2和01239、05727在酵母中的互作，但是它們二者間的互作在真菌中發揮的生理作用尚不清楚，這為深入研究信息素受體的功能提供了基礎以及為后期的CO-IP、Poll-Down實驗提供了基礎前提。

[1] 王群,王石,劉小縵,等.絲孢真菌無性與有性進化分析[J].菌物研究,2017,15(4):213-221

[2] Wallroth FG. Flora[J]. Google Scholar, 1833,2:182-184

[3] Inderbitzin P, Mehta YR, Berbee ML. Pleospora species withanamorphs: a four locus phylogeny resolves new lineages yet does not distinguish among species in theclade[J]. Mycologia, 2009,101(3):329-339

[4] Jenness DD, Burholder AC, Hartwell LH. Binding of K-factor pheromone to yeast a cells: Chemical and genetic evidence for an K-factor receptor[J]. Cell, 1983,35(2 Pt 1):521-529

[5] Nakayama N, Miyajima A, Arai K. Nucleotide sequences of STE2 and STE3, cell type-specic sterile genes from[J]. The EMBO Journal, 1985,4(10):2643-2648

[6] 武明花,李桂源.分離的泛素系統----—種新型的膜蛋白酵母雙雜交系統[J].國外醫學遺傳學分冊,2005,28(2):88-90

[7] Fields S, Song OK. A novel genetic system to detect protein-protein interactions[J]. Nature, 1989,40(18):245-246

[8] Coates PJ, Hall PA. The yeast two-hybrid system for identifying protein-protein interactions[J]. J Pathol, 2003,199(l):4-7

[9] Brachmann RK, Boeke JD. Tag games in yeast: the two-hybrid system and beyond[J]. Curr Opin Biotechnol, 1997,8(5):561-568

[10] Reinders A, Schulze W, Thaminy S,. Intra- and intermolecular interactions in sucrose transporters at the plasma membrane detected by the split-ubiquitin system and functional assays[J]. Structure, 2002,10(6):763-772

[11] Stagljar I, Korostensky C, Johnsson N,. A genetic system based on split-ubiquitin for the analysis of interactions between membrane proteins in vivo[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1998,95(9):5187-5192

[12] Johnsson N, Varshavsky A. Split ubiquitin as a sensor of protein interactions in vivo[J]. Proc. Nati. Acad. Sci., 1994,91:10340-10344

[13] 藺芳芳,楊旭,武小翠,等.利用分裂泛素酵母雙雜交技術釣取小麥TaSC互作蛋白質[J].作物學報,2013,39(3):423-430

Pheromone Factor STE2 Protein Interaction Split Studied by Ubiquitinated Yeast Two-hybrid System

LIU Xiao-man1, WANG Qun2, WANG Shi2, GAO Su-su2, WANG Xiao-me1*

1.130118,2.271018,

The evolution, differentiation and sexual development of fungi are regulated by several sex genes, such as mating type, pheromone factors and heterotrimeric G-protein-subunit genes. At the same time, regulatory factor pheromone sexual reproduction of fungi are also well studied in.is an important group of fungi in filamentous ascomy fungi, and many filamentous ascospora genus and species contain pheromone factors. In nature, Most of thefungi are in the form of asexuality, but a small part of them also have sexual reproduction. In order to further study the effect of pheromone receptor STE2 and its related genes on the sexual reproduction of typical species of the, this study selected, a typical species of the genus, containing the pheromone factor STE2, and cloned and identified the information receptor STE2, and then constructed on the bait protein expression vector, the cDNA library is screened to obtain several suspected interaction protein fragments, and the full length of the gene is cloned into the prey protein expression vector, and the split ubiquitinated membrane yeast two-hybrid system was used to perform one-to-one validation screening of STE2 related interaction protein. The results of the interaction protein screened by this study provide the basic premise for the later CO-IP and Poll-Down experiments.

Pheromone factor STE2;; split ubiquitin yeast two-hybrid system; interaction protein

S763.15; Q7

A

1000-2324(2019)01-0035-05

10.3969/j.issn.1000-2324.2019.01.007

2018-05-12

2018-07-02

國家自然科學基金重點項目(31230001)

劉小縵(1991-),女,在讀碩士研究生.研究方向:植物病原真菌學和真菌資源. E-mail:2231969708@qq.com

Author for correspondence. E-mail:wxm820@126.com