瞬時沉默乙醛脫氫酶對辣椒疫霉效應因子RxLR129113功能的影響

王儷穎,梁濤,朱彤彤,馬艷飛,江偉霖,冀瑞卿*,張修國*

?

瞬時沉默乙醛脫氫酶對辣椒疫霉效應因子RxLR129113功能的影響

王儷穎1,梁濤1,朱彤彤2,馬艷飛2,江偉霖2,冀瑞卿1*,張修國2*

1. 吉林農業大學食藥用菌教育部工程研究中心, 吉林 長春 130118 2. 山東省蔬菜病蟲生物學重點實驗室 山東農業大學植物保護學院, 山東 泰安 271018

辣椒疫霉菌（）產生的效應因子RxLR129113在本氏煙上的功能之一是抑制BAX引起的細胞壞死，而且已經證實乙醛脫氫酶（ALDH）是RxLR129113的互作蛋白。為了探究乙醛脫氫酶（ALDH）是否影響Rx LR129113抑制BAX引起的細胞壞死，本研究利用病毒誘導的基因沉默（VIGS）技術，克隆了乙醛脫氫酶（ALDH）基因片段，插入到煙草脆裂病毒載體（TRV）中，構建了pTRV -ALDH的VIGS載體，轉入農桿菌侵染本氏煙后qrt-PCR驗證成功沉默了ALDH基因。在沉默ALDH基因的本氏煙上瞬時表達RxLR129113，24 h接種BAX。結果表明，在NbALDH沉默植株上，RxLR129113仍然抑制BAX引起的細胞壞死。本研究結果表明RxLR129113與ALDH互作不影響其抑制BAX引起的細胞壞死，為進一步深入開展辣椒疫霉效應因子RxLR129113功能機制研究奠定了基礎。

辣椒疫霉; 實時熒光定量PCR; 基因沉默（VIGS）技術; 表達量

辣椒疫霉菌() 是一種農業生產上重要的土傳病原菌，可引起辣椒、甜椒、黃瓜、茄子、大豆等9科20多種作物的莖腐、根腐和枯萎[1]。卵菌侵染寄主植物時會分泌大量的效應分子，依據效應蛋白分子在植物細胞的靶標位點，可將其劃分為兩大類群，一類是胞間效應蛋白（Apoplastic effector），在植物細胞間累積，通過與胞間靶標蛋白或細胞膜受體結合發生作用；另一類是胞內效應蛋白（Cytoplasmic effector）[2]，分泌病菌胞外后，轉至寄主植物細胞內，通過作用于寄主植物胞內靶標抑制寄主的防衛反應，或被植物抗病蛋白識別激發過敏性壞死反應，如卵菌效應蛋白Avr1b和Avr3a，均可被寄主抗病蛋白識別，激發過敏性壞死反應。其中RxLR效應分子屬于胞內效應蛋白。RxLR效應分子的N端有一段RxLR-dEER基序的基因序列[3]，其中x為任意氨基酸。研究發現，卵菌含有RxLR-dEER基序的效應蛋白在病原物與植物互作過程中具有抑制植物防衛反應的作用，其模式蛋白分為兩個功能區：N端區，包括信號肽和RxLR motif起到外泌和定位的作用，其余的C端區則表現效應因子的活性區，常有W、Y、L、K保守域[4]。

病毒誘導的基因沉默（VIGS）是發現于高等植物的轉錄后基因沉默現象，是宿主抵抗病毒的一種自我保護機制[5]。病毒侵染植物組織后進行復制，合成大量的雙鏈RNA中間體（Double stranded RNA，dsRNA），隨之宿主體內具有核酸內切酶活性的Dicer類似物將其切割為小分子干擾RNA（small interfering RNA，si RNA），si RNA與一系列AGO（argonaute）家族蛋白結合形成RNA誘導的沉默復合物（RNA-induced silencing complex，RISC），后者特異性識別細胞質中的同源mRNA，并將其切割降解，從而發生基因在轉錄水平的沉默[6-8]。病毒誘導的基因沉默技術是近年發展起來研究植物基因功能的新方法[9]。利用含有目的基因片段的病毒載體侵染植物，導致植物體內相應的基因表達受到抑制成為沉默基因，可以初步推測目的基因的功能。與轉基因、基因敲除等基因功能研究方法相比，VIGS技術具有研究周期短、不需要遺傳轉化、低成本、高通量的優勢，已被廣泛應用于植物生長發育以及代謝調控途徑相關基因的功能鑒定[10]。

煙草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV）是目前應用最廣泛的VIGS載體，它便于外源序列的插入和隨后對植物的侵染，具有病毒感染癥狀輕、沉默效率高等優點，在煙草、擬南芥等多種植物上得到了廣泛應用[11]。RxLR129113與乙醛脫氫酶（ALDH）通過酵母雙雜，Co-IP和雙分子熒光證明互作。本實驗以乙醛脫氫酶（ALDH）為沉默對象，實驗室本氏煙為供試材料，進而在已沉默乙醛脫氫酶（ALDH）的本氏煙上驗證RxLR129113是否抑制BAX引起的壞死。研究結果為RxLR129113與乙醛脫氫酶（ALDH）的互作機制奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

供試煙草為本實驗室保存的本氏煙。本氏煙種植于溫室，溫度25 ℃左右，光照14 h，黑暗10 h,，萌發3~4周的煙草幼苗適用。

Trans5α、GV3101購自北京全式金生物技術有限公司；內切酶FastDigest Kpn I、FastDigest Xba I購自ThermoFisher Biotechnology Company。pTRV﹕RNA1質粒和pTRV﹕RNA2質粒由清華大學劉玉樂老師惠贈。

1.2 引物設計

應用Primier Quest Tool（http://sg.idtdna.com/Primer Quest/Home/Index）軟件對乙醛脫氫酶（ALDH）特異位點設計特異性熒光定量PCR引物。通過Blast program（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比對所設計的引物序列與其它生物種屬之間的同源性及其同源二聚體的有無。引物由上海博尚基因公司合成后對特異性進行篩選與評價。

1.3 VIGS載體的構建

選取NbALDH基因的全長cDNA序列信息設計引物，選取300 bp左右的序列，兩端引入限制性內切酶Kpn I和Xba I的酶切位點。通過PCR反應擴增得到NbALDH基因片段。將此片段克隆到pTRV: RNA2載體上，轉化大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆，PCR驗證并測序，測序正確，提質粒，并轉入農桿菌GV3101。

1.4 VIGS實驗

將上述攜帶3種質粒的農桿菌（pTRV1、pTRV2和pTRV2—ALDH）分別在28 ℃振蕩培養過夜。4000 rpm離心5 min收集農桿菌，充分倒盡上清后，用農桿菌滲透液重懸細菌調整農桿菌懸浮液的OD600值為1.0左右，靜置3~5 h后，將等體積的pTRV1農桿菌懸浮液和pTRV2－ALDH農桿菌懸浮液混合均勻后，開始注射本氏煙草葉片。所注射的本氏煙草為萌發3~4周的幼苗，具有4~6片真葉的茁壯生長的植株，用注射器將混合菌液通過壓迫注射法接種煙草葉片。

1.5 RNA的提取，cDNA合成與純度、濃度檢測

在本氏煙接種TRV病毒后10 d，采用OMEGA植物RNA提取試劑盒進行本氏煙RNA提取，參照試劑盒說明書進行操作提取RNA。以RNA為模板，參照諾唯贊反轉錄試劑盒說明書，在冰上進行反轉錄實驗，反應體系如下：4×gDNA wiper Mix 4 μL，模板RNA 1 μg，RNase free dd H2O to 16 μL，42 ℃ 2 min；在第一步反應管中直接加入5×Hi ScriptⅡq RT Super MixⅡ4 μL，第一步反應液16 μL；50 ℃ 15 min，85 ℃5 s。用分光光度計檢測樣品的濃度與純度，并將cDNA的濃度稀釋到0.1 μg·μl-1，-20 ℃保存。

1.6 熒光定量PCR標準曲線的建立

以稀釋后的cDNA為模板，構建實時熒光定量PCR標準曲線，每個反應3次重復。反應體系為2*Super Real Pre Mix Plus 10 μL，上下游引物各0.4 L，cDNA模板4 μL，dd H2O補足至20 μL。以模板DNA濃度對數值為橫坐標，反應循環數(Ct)值為縱坐標繪制標準曲線。

1.7 沉默乙醛脫氫酶的本氏煙瞬時表達RxLR129113

若驗證在本氏煙上已經瞬時沉默了乙醛脫氫酶，將Rx LR129113，GFP，BAX分別在28 ℃振蕩培養過夜。4000 rpm離心5 min收集農桿菌，充分倒盡上清液后，用農桿菌滲透液重懸細菌調整OD600值為0.5左右，靜置3~5 h后，在本氏煙草葉片接種RxLR129113，24 h后接種BAX。

1.8 臺盼藍染色

配制臺盼藍染色液原液：取10 g苯酚、10m L乳酸、10m L甘油、10m L水和0.02 g臺盼藍混勻；配制水合氯醛脫色液：將1000 g水合氯醛溶于400 mL水中；先將配制好的臺盼藍原液加2倍體積的95%酒精稀釋，取適量的染色液（根據葉片的多少而定）加到燒杯中，水浴預熱1 min，加入接種的葉片，煮沸1~2 min，過夜放置；第2天將葉片轉移到配好的水合氯醛脫色液中，反復更換水合氯醛脫色液數次，直到壞死部位呈藍色，其他葉片組織呈透明色；將處理好的葉片放入95%酒精中，使葉片的對比度更加明顯，并且使葉片變得結實，利于進一步的照相；將染色后的葉片照相，與未染色的葉片一一對應。

圖 1 電泳檢測接種pTRV1+pTRV2和pTRV2-ALDH本氏煙的RNA

2 結果與分析

2.1 RNA的提取

注射接種pTRV1和pTRV2－ALDH菌液10~14 d后，以pTRV1和pTRV2為對照，對葉片進行RNA的提取。提取RNA經紫外分光光度計檢測，OD260/OD280 值均在1.9~2.0之間，說明所提取的總RNA純度較高，OD260/OD230 值均在2.0左右，說明提取的RNA沒有鹽離子污染。1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示28SrRNA、18SrRNA兩條帶清晰銳利(圖1)，表明RNA未出現降解現象，符合進一步實驗要求。

2.2 NbALDH基因沉默的熒光定量PCR結果

NbALDH在本氏煙中的表達量是相對于Nbactin的表達量而確定的。以接種pTRV1和pTRV2 的本氏煙作為對照，檢測NbALDH的表達量。從圖2-1，2-2的熒光定量PCR結果可以得出本氏煙的NbALDH基因沉默效率達70~80%，即沉默成功。

圖 2-1 NbALDH熒光定量PCR擴增曲線

Fig.2-1 Real-time fluorescence quantitative standard curve of NbALDH

圖 2-2 NbALDH熒光定量PCR表達模式分析

Fig.2-2 Real-time fluorescence expression patterns of NbALDH

2.3 沉默乙醛脫氫酶的本氏煙上瞬時表達RxLR129113能抑制BAX引起的細胞壞死

以GFP、Buffer作為對照在沉默乙醛脫氫酶本氏煙上瞬時表達RxLR129113，24 h后接種能夠誘導細胞死亡的BAX，以接種pTRV1和pTRV2的本氏煙為對照。接種一周后觀察RxLR129113能夠抑制BAX引起的細胞死亡，實驗結果如圖3（左），3（右）。

圖 3 RxLR129113分別在pTRV1+pTRV2（左）和沉默ALDH（右）本氏煙上抑制細胞死亡分析

Fig.3 Analysis of inhibition of cell death by effector RxLR129113 on pTRV1+pTRV2 (left) and silenced ALDH (right)

A：Rx LR129113+24 h BAX；B：GFP+24 h BAX；C：Buffer+24 h BAX，接種7 d后照相. 右圖是臺盼藍染色結果

A: Rx LR129113+24 h BAX; B: GFP+24 h BAX; C: Buffer+24 h BAX, photographs was taken in 7 days post‐inoculation (dpi). Right photograph is the trypan blue staining result.

3 討論

本研究采用的VIGS載體都是以天然植物病毒為基礎的，某些VIGS載體就會有一些物種特異性的限制。迄今為止，煙草脆裂病毒載體是使用最廣泛的VIGS載體，與其他病毒載體相比，TRV-VIGS載體具有插入目的基因長，誘導基因沉默效率高，持久性長，對宿主不會造成明顯傷害等優點[12-13]，在煙草、擬南芥等多種植物上得到了廣泛應用。本試驗采用煙草脆裂病毒為載體，在本氏煙上沉默NbALDH，驗證了RxLR129113仍然抑制BAX引起的壞死。由此說明，RxLR129113與互作蛋白ALDH互作并不影響對BAX的抑制，可以繼續在本氏煙上沉默NbALDH驗證RxLR129113的其它功能是否發生變化，為進一步研究RxLR129113與互作蛋白ALDH互作機制奠定了基礎。

[1] 徐靜靜,王曉鳴,段燦星,等.大豆疫霉基因組SSR標記開發[J].中國農業科學,2009,42(9):3112-3122

[2] Wang Y, Bouwmeester K, Van de Mortel JE,. A novel Arabidopsis-oomycete pathosystem: differential interactions withreveal a role for camalexin,indole glucosinolates and salicylic acid in defence[J]. Plant Cell and Environment, 2013,36(6):1192-1203

[3] Shen DY, Li QL, Sun P,. Intrinsic disorder is a common structural characteristic of RxLR effectors in Oomycete pathogens[J]. Fungal Biology, 2017,121(11):911-919

[4] Kamoun S. A catalogue of the effector secretome of plant pathogenic Oomycetes[J]. Annual Review of Phytopathology, 2005,44(1):41-60

[5] VanKannen A. Virus-induced gene silencing in infected and trans-genic plants[J]. Trends PlantSci, 1997,2(11):409-411

[6] Baulcombe D. RNA silencing in plants[J]. Nature, 2004,431:356-363

[7] Mlotshwa S, Pruss GJ, Vance V. Small RNAs inviral infection and host defense[J]. Trends Plant Sci, 2008,13(7):375-382

[8] Voinnet O. Induction and suppression of RNA silencing: insights from viral infections[J]. Nat Rev Genet, 2005,6(3):206-220

[9] Boulcom DC. Fast forward genetics based on virus-induced gene silencing[J]. Curr Opin Plant Biol, 1999,2(2):109-113

[10] Lu R, Malcuit I, Moffett P,. High through putvirus-induced gene silencing implicate sheat shock protein 90 in plant disease resistance[J]. EMBO J, 2003,22(21):5690-5699

[11] Liu YL, Schiff M, Dinesh-kumar SP. Virus-induced gene silencing in tomato[J]. Plant J, 2002,31(6):777-786

[12] Zhu X, Dinesh-Kumar SP. Virus-induced gene silencing as a tool to identify host genes affecting viral pathogenicity[J]. Methods in Molecular Biology, 2008,451:641-648

[13] Senthil-Kumar M, Hema R, Anand A,A systematic study to determine the extent of gene silencing inand other Solanaceae species when heterologous gene sequences are used for virus-induced gene silencing. New Phytologist, 2007,176:782-791

Effect of Transient Silencing of Acetaldehyde Dehydrogenase on the Function ofRxLR129113

WANG Li-ying1, LIANG Tao1, ZHU Tong-tong2, MA Yan-fei2, JIANG Wei-lin2, Ji Rui-qing1, ZHANG Xiu-guo2*

1.130118,2.271018,

One of the functions of theeffector RxLR129113 onis to inhibit BAX-induced cell necrosis, and acetaldehyde dehydrogenase (ALDH) has been shown to be an interaction protein of RxLR129113. To investigate whether aldehyde dehydrogenase (ALDH) affects RxLR129113 inhibition of BAX-induced cell necrosis, this study cloned the aldehyde dehydrogenase (ALDH) gene fragment and inserted it into tobacco using virus-induced gene silencing (VIGS) technology. In the fragile virus vector (TRV), the VIGS vector of pTRV-ALDH was constructed, and the ALDH gene was successfully silenced by qrt-PCR after agrobacterium infecting. RxLR129113 was transiently expressed onwith silenced ALDH gene, and BAX was inoculated 24 h. The results showed that RxLR 129113 still inhibited BAX-induced cell necrosis on NbALDH-silenced plants. The results of this study indicate that the interaction between RxLR129113 and ALDH does not affect the inhibition of BAX-induced cell necrosis, which lays a foundation for further research on the functional mechanism ofeffector RxLR129113.

; real-time fluorescent quantitative PCR; gene silencing (VIGS) technology; expression

S436.418.1+2

A

1000-2324(2019)01-0031-04

10.3969/j.issn.1000-2324.2019.01.006

2018-04-23

2018-06-02

國家大宗蔬菜產業技術體系(CARS-25-03B)

王儷穎(1993-),女,在讀碩士研究生.研究方向:植物病原真菌學和真菌資源利用. E-mail:1479779905@qq.com

Author for correspondence. E-mail:jiruiqingjrq@126.com; Zhxg@sdau.edu.cn