普通高中植物組織培養實驗室的建設與課程實踐

錢敏艷 王曉芳

摘要 敘述了普通高中應如何開展植物組培實驗的建設和課程開發以及組織培養過程中的一些成功的經驗和不足之處的反思。

關鍵詞 植物組織培養 實驗室建設 課程實踐

中圖分類號 G633.91

文獻標志碼 B

1新課標對植物組織培養技術的要求

《普通高中生物學課程標準（2017年版）》（以下簡稱新課標）的基本理念強調以核心素養為宗旨，教學過程重實踐，在教學過程中要讓學生主動參與學習過程，多動手動腦，加深對生物學概念的理解，進而提升應用知識的能力。在新的高中生物學課程結構中，選擇性必修模塊《生物技術與工程》以及選修模塊“學業發展基礎”都要求學習植物組織培養技術。選擇性必修模塊《生物技術與工程》的內容標準中要求學生闡明植物組織培養是在一定條件下，將離體植物器官、組織和細胞在適宜的培養條件下誘導形成愈傷組織，并重新分化，最終形成完整植株的過程。新課標認為植物組織培養室不需要昂貴的儀器設備和藥品，投資少，可以在短時間內不受自然條件限制培育出大量具有優良性狀的幼苗。在新課標下，建設一個適合學生使用的植物組織培養實驗室將成為必然。

2植物組織培養實驗室的改建與設備購置

作為一般的普通高中，建設一個與大學實驗室條件相當的植物組織培養室需要30萬左右的資金，實現的可能性較小。我校的自然科學實驗中心雖為江蘇省課程基地項目，但由于是數理化生共建的項目，所以經費也并不是太充裕。為了既能適應新課程標準對教學的要求，又能在力所能及的范圍內完成實驗室改造，我校對植物組織培養實驗室進行了如下的建設，總體的費用約10萬。

2.1實驗室的改建

通過對高校和一些中學生物課程基地校植物組織培養實驗室的參觀學習，以及與生物技術公司的交流，選擇了一間光線良好、長12m、寬8m的普通實驗室進行改造。為了滿足植物組織培養室的各種條件，把實驗室分成了更衣室、無菌室、培養室、煉苗室、教學區等區域。

2.2實驗設備的購置

植物組織培養過程中對無菌的要求很高，我校在改建中為了節省成本，沒有建風淋室。為了保證實驗效果，購置了紫外滅菌燈放在無菌室，用于實驗前的環境消毒。除此之外，高壓滅菌鍋、超凈工作臺、接種器具殺菌器、組培接種服等都是滿足無菌條件的重要保障。決定組織培養能夠成功的另一重要因素是培養基，教師可以根據教材上的培養基配方自己配制，也可以直接從生物技術公司購買MS培養基。MS培養基中的各種元素比例要求嚴格，如果直接拿自來水來配制也會導致實驗的失敗，因此需要用純水器來制備超純水。接種后的無菌苗必須置于潔凈度高、光照充足、溫濕度適宜的環境。智能光照培養箱能夠滿足以上要求，它與光照培養架的不同在于可以提供恒定的溫度，具有溫度、光照度程序設定功能，能夠滿足實驗的要求。具體設備購置情況見表1，如果實驗室建設經費有限，其中的移液器、電熱鼓風干燥箱可以暫不購置。

3課程開發

3.1課程說明

植物組織培養是基于植物細胞具有全能性這一理論，近幾十年發展起來的一項植物體無性繁殖的新技術。通過本課程的學習，學生將掌握植物組織培養基制備、外植體接種、繼代培養、移栽等相關知識和技能，初步具備植物組織培養的職業素養，為今后大學專業選擇提供指導，奠定基礎。本課程的成績評定將由以下三部分組成：

1學生的課堂表現占20%，包括出勤率、課堂參與程度;2實驗過程的規范性和實驗成功率占50%;3學習撰寫相應的小論文占30%。

3.2課程目標

1通過本課程的學習，能說出植物組織培養實驗室常用的儀器、設備及用具的使用方法;明確植物組織培養工作的程序，說出無菌操作的原則;掌握培養基配制與滅菌、接種、培養及組培苗馴化移栽的方法;能分析實驗操作過程中成敗的原因。

2通過本課程的學習，能正確使用并維護植物組織培養實驗室的儀器與設備;熟悉植物組織培養技術的程序，遵循無菌操作原則進行培養基的配制與滅菌、接種、培養及組培苗馴化移栽;能夠按照培養對象正確選擇有效的培養基，正確調控培養條件;成功培養一些植物器官。

3.3課程內容設計

從植物組織培養課程選題，將植物組織培養技術所需要的知識和技能進行整合和簡化，使之適合我校現有的實驗條件和高中學生能接受的程度，形成植物組織培養課程教學的兩個課程單元，共整合為8個主題：單元一“植物組織培養基本操作技術”;單元二“植物組織培養實際應用技術”。這些主題覆蓋了植物組織培養實驗室內操作的全部過程，具體教學內容與學時分配如下。

單元一“植物組織培養基本操作技術”包括：

1植物組織培養的基本認識（共2個課時）——植物組織培養的概念、植物細胞的全能性、脫分化與再分化;

2植物組織培養實驗及設備使用（共2個課時）——植物組織培養實驗室的設置、常用設備儀器及使用、常用器皿的洗滌;

3培養基配制（共2個課時）——培養基的營養要求和環境要求、培養基的基本類型、母液的配制方法與培養基的配制;

4外植體接種（共2個課時）——如何選擇外植體、外植體的表面滅菌、常用的表面滅菌劑、外植體接種。

單元二“植物組織培養實際應用技術”包括：

1矮牽牛莖尖組織培養（共2個課時）;

2煙草不定芽誘導及完整植株形成（共2個課時）;

3菊花莖尖與花瓣組織培養（共2個課時）;

4石斛植物離體快繁（共1個課時）。

學生實踐參觀，整理實驗報告，整理小論文（2個課時）。另有1個課時作為機動安排。

3.4實驗操作評價

在上述8個主題的教學活動中，每個學習小組必須完成四個方面的操作內容作為實驗評價的依據，包括：

（1）每組學生每人能獨立完成組培室的無菌操作，減少組培苗的雜菌感染率;

（2）每組分別配制大量元素母液1000mL、微量元素母液1000mL、鐵鹽母液1000mL、有機物母液500mL;

（3）選擇1或2種外植體進行預處理，并完成外植體表面滅菌的任務;

（4）每組完成根、莖、葉外植體各20瓶培養基接種任務。

4植物組織培養實踐——以矮牽牛為例

4.1培養基的配制

取出母液和植物生長調節劑溶液并按順序放好。將潔凈的各種器皿，如量筒、燒杯、移液管、移液槍和玻璃棒等放在合適位置。取一只1L燒杯，放入約500mL蒸餾水，依次加入大量元素母液1（100mL）、微量元素母液2（10mL）、鐵鹽母液3（10mL）和有機物質母液4（5mL），并不斷攪拌。加入瓊脂（通常5.0～7.0g/L），加熱使其完全溶解。加入30g蔗糖，待蔗糖溶解后加蒸餾水定容至1L。調整pH至5.6～5.8，用預先配好的氫氧化鈉或鹽酸進行調節。

4.2培養基的分裝、滅菌

將1000mL培養基分裝進滅菌后的20個小型培養瓶，每瓶約50mL培養基。將分裝過后的培養瓶再次用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌20min，滅菌后待高壓鍋壓力下降到0Pa時取出，待培養基溫度降至40～50°C時，在超凈工作臺上加入過濾除菌的生長調節物質，50mL培養基加0.1mL的NAA和0.1mL的6-BA，用移液槍取樣，充分混合后靜置凝固后再用。實驗過程中需要用的無菌水、接種盤等可同時高壓滅菌。

4.3對無菌接種間滅菌

每次接種操作前提前3h打開接種間的紫外燈消毒，把整個實驗所需用到的實驗材料和器材放到超凈工作臺內用紫外燈再滅菌數小時。超凈工作臺中放有接種器械滅菌器，實驗過程中需要用到的鑷子、剪刀等用具插入接種器具滅菌器（300°C）中滅菌。

4.4實驗操作者的消毒

操作者進入接種室前，要在準備室內用溫水和肥皂清洗雙手并擦干，指甲縫內要用酒精特別消毒，不允許留長指甲。進入接種間前換上消毒好的接種服，在超凈工作臺里進行接種操作之前，用體積分數為70%的酒精擦拭雙手。

4.5外植體的獲取和接種

從已有的組培苗中剪取外植體，可以盡可能避免雜菌污染。植株不同部位的組織、器官中生理狀態有很大不同，對培養基的反應也不同，因此選擇合適的外植體對于實驗能否成功很重要。外植體可分為帶芽的外植體和分化組織構成的外植體，如帶有側芽的莖尖就是帶芽外植體。對于大多數植物來說，莖尖無疑是較好的取材部位，因為其形態已基本形成，生長速度快，莖段側芽或頂芽容易萌發。打開已有組培苗的培養瓶，取出矮牽牛小苗于接種盤中，用消毒并冷卻的剪刀和鑷子剪取矮牽牛莖尖的莖段，打開裝有培養基的培養瓶，插入莖段并迅速蓋上瓶蓋，插入時注意莖段的方向，不要倒插。此過程中，如果是教師操作，可在酒精燈周圍進行實驗操作，接種完成后培養瓶口和瓶蓋在火焰上過幾圈可以更好地防止雜菌污染。如果是學生操作，可以不使用酒精燈，以免操作臺內物品太多造成危險。使用過的器械可用無菌水沖洗后重新插入高溫滅菌器滅菌，進行下一次操作。

4.6接種后外植體的培養、觀察

待同一批接種完畢后，取出培養瓶并貼上標簽，標注接種材料和日期，然后放入智能光照培養箱培養。溫度設置為25°C，光照、黑暗各12h交替進行。實驗記錄顯示3月7日接種15瓶矮牽牛，一星期后就有部分外植體長出了新芽，有兩瓶發生了雜菌污染，其余長勢良好.兩周后，取出培養瓶移入光照培養架。4月7日觀察時發現有一瓶矮牽牛已開出紫色小花。

5實驗過程中的經驗與反思

5.1成功經驗總結

5.1.1取材的方法

按照植物的生長規律，在春夏季節取材，材料幼嫩，細胞分裂旺盛，室外氣溫適宜，組織培養容易取得成功;反之，秋冬季節進行實驗，培養成功概率相對較低。

5.1.2培養基的配制

培養基配制的過程中，水浴加熱時間太長，影響學生實驗過程，所以可用700W微波爐高火加熱7min，效果與水浴加熱相同。高壓滅菌時，玻璃培養瓶可滅菌25min，塑料培養瓶滅菌20min，滅菌時間過長會導致瓊脂變質、不易凝固。滅菌結束后應立即把培養基取出放入超凈工作臺冷卻，因為如果在高壓滅菌鍋中冷卻，由于余溫仍很高，培養基會變黃。

5.1.3超凈工作臺的使用

超凈工作臺在接種前關掉紫外燈，工作臺拉門打開少許，等待2min，待臭氧氣體排出后再進行操作，同時打開照明燈，風扇速度調至慢速。實驗操作者雙手伸入超凈工作臺，盡可能不要有著有衣物部分進入，雙手及手腕處多用酒精棉球擦拭幾遍。超凈臺中接種器械滅菌器內鑷子溫度很高，使用時需先取出冷卻或沒入無菌水冷卻，避免燙傷外植體。

5.2困難與反思

我校改造的無菌室可放置3-4臺超凈工作臺，可容納的學生人數少。每次教學活動時，學生只能分批進行實驗。學生操作培養的試管苗被污染率要明顯高于教師培養的試管苗，說明學生進行操作時消毒跟滅菌過程中還不夠徹底。目前成功接種了大量的矮牽牛、菊花、煙草苗，均是以莖尖為實驗材料直接培養出了根和芽，而沒見到愈傷組織。如需觀察愈傷組織，則在MS培養基的基礎上還需添加等量的0.2mg/mL的細胞分裂素和生長素，并進行暗培養，這還需進行進一步的探究。