冷凍胚胎復蘇后發育情況與妊娠結局的關系

沈智君， 張迅軼， 楊 峰， 楊 敏， 陳子昂， 紀亞忠

(同濟大學附屬同濟醫院生殖醫學中心，上海 200065)

自1983年世界首例凍融胚胎移植試管嬰兒獲得成功妊娠以來，冷凍胚胎移植(frozen-thawed embryo transfer, FET)技術作為體外受精-胚胎移植的常規治療技術之一，已廣泛應用于人類輔助生殖技術領域。FET在預防卵巢過度刺激綜合征(ovarian hyperstimulation syndrome, OHSS)的發生、提高累積妊娠率、減少促排卵次數、降低異位妊娠風險等方面具有重要意義，而影響FET妊娠率的主要因素包括年齡、臨床用藥方案、胚胎質量、子宮內膜的容受性以及胚胎與子宮內膜的同步化等，其中胚胎質量是決定FET成功的重要環節之一[1-2]。另外，FET的實施方案可分為當天解凍并移植以及解凍后培養18～20h后移植，并按照指南的標準對解凍后及過夜培養后的胚胎質量進行評分[3]。本研究通過觀察胚胎解凍并過夜培養18～20h后卵裂球的增殖情況，計算卵裂球的增殖比例，分組進行分析及探討其與FET妊娠結局的相關性，以期為判斷胚胎的發育潛能及臨床妊娠結局提供更多的參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2015年1月—2016年12月在同濟大學附屬同濟醫院生殖醫學科行FET的周期，納入研究的臨床及實驗室標準為： (1) 女方因盆腔輸卵管、排卵障礙、子宮內膜異位癥等因素，或免疫因素、不明原因等不孕，以及男方因少、弱、畸精或無精癥等因素不育；(2) 所有內膜準備方案均為人工周期的冷凍胚胎移植周期；(3) 所有解凍移植的胚胎均為授精后72h的第3天(D3)卵裂期胚胎；(4) 解凍后培養時間為18～20h；(5) 2枚胚胎均解凍后均有≥50%的卵裂球存活的復蘇胚胎；培養后均有卵裂球增殖或與解凍后卵裂球數量相同，無逆分裂或卵裂球數少于解凍后現象；2枚胚胎均予以移植。

1.2 方法

1.2.1 內膜準備及移植 均采用人工周期進行移植前內膜準備。月經周期第2～3天行陰道超聲，根據患者基礎內分泌激素和內膜情況采用戊酸雌二醇行人工周期治療，黃體酮轉化內膜3d后移植。

1.2.2 玻璃化冷凍、解凍及胚胎培養 使用Origio玻璃化冷凍試劑盒(MEDICULT，丹麥)對D3卵裂期胚胎進行冷凍。該試劑盒包括平衡液和玻化液，所有操作于室溫進行，將胚胎置于平衡液中，胚胎經歷從皺縮到重新擴張的過程，大約5min后轉移至玻化液，并在1min內裝載于載桿前端，立即投入液氮保存。在擬移植時間的前18～20h解凍胚胎，使用Origio玻璃化解凍試劑盒對D3卵裂期胚胎進行解凍。該試劑盒包括解凍液、稀釋液1、稀釋液2及洗滌液，將胚胎從液氮中取出，置于37℃的解凍液中，隨后每隔3min依次將胚胎轉移至室溫的稀釋液1、稀釋液2及洗滌液中，最后轉入37℃的含人血清替代品(Synthetic Serum Substitute Irvine，美國)的胚胎培養液(Continuous Single Culture， Irvine，美國)中繼續培養18～20h，培養環境為37℃、5% CO2及5% O2(ASTEC 30L三氣培養箱，ASTEC，日本)。

1.2.3 胚胎分級評估及卵裂球增殖計算方式 結合伊斯坦布爾胚胎評分標準及中心實驗室經驗，根據卵裂球數、碎片量、卵裂球大小均一性等對所有納入研究的胚胎進行冷凍前、解凍后及培養后的評級[3]。I級胚胎： 7～9細胞，卵裂球大小均勻，碎片<5%，無空泡；Ⅱ級胚胎： ≥6細胞，卵裂球大小均勻或大致均勻，碎片5%～10%，無或有少量空泡；Ⅲ級胚胎： ≥5細胞，卵裂球大小不均勻，碎片10%～20%，可有空泡；Ⅳ級胚胎： ≤4細胞或碎片>20%，卵裂球大小不均勻。另外，使用公式[(培養后卵裂球數量-解凍后卵裂球數量)/解凍后卵裂球數量]×100%，計算胚胎培養后卵裂球的增殖百分率。

1.2.4 胚胎分組 本項研究分析了納入統計周期的女方患者年齡、不孕年限、BMI、移植日內膜厚度及復蘇胚胎繼續培養的胚胎增殖情況，其中胚胎增殖分組： (1) 根據移植的2枚胚胎卵裂球是否增殖，分為0枚生長組(S0)；1枚生長組(S1)及2枚生長組(S2)。(2) 在2枚生長組(S2)中，根據卵裂球增殖情況或增殖百分比。分為a組： 增殖形成桑葚胚或早期囊胚；b組： 卵裂球增殖率≥50%；c組： 50%>卵裂球增殖率≥25%；d組： 卵裂球增殖率<25%，移植2枚胚胎，則分為aa、ab、ac、ad、bb、bc、bd、cc、cd、dd共10組。

1.2.5 確定妊娠及隨訪 移植后12d檢測血β-hCG，若血β-hCG>5 IU/L提示生化妊娠，48h后復查翻倍情況，若翻倍良好則繼續黃體支持；若血β-hCG<5 IU/L，則停藥待月經。移植后28d陰道超聲檢查，見孕囊、胚芽、心管搏動者確定為臨床妊娠，繼續黃體支持至妊娠10～12周，并隨訪至活產。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 一般臨床結果

本研究經納入條件篩選，共選取991個FET周期，女性患者平均年齡為(32.90±6.25)歲，臨床妊娠周期424個，臨床妊娠率(臨床妊娠周期/周期數)42.79%；移植胚胎1982枚，孕囊數535個，胚胎種植率(孕囊數/移植胚胎數)26.99%；多胎妊娠75例，多胎妊娠率(多胎妊娠周期數/臨床妊娠周期數)17.69%；流產率(流產周期數/臨床妊娠周期數)28.3%。年齡在各個分組間差異均無統計學意義(P>0.05)。

2.2 培養后2枚胚胎卵裂球是否增殖與妊娠結局的關系

胚胎解凍經18～20h培養后移植，S2組的臨床妊娠率和胚胎種植率顯著高于S1組(P<0.01)，而S1組又顯著高于S0組(P<0.01)；同時，S1組的流產率顯著高于S2組(P<0.01)；另外，S2組的多胎妊娠率顯著高于S1組(P<0.01)，見表1。

表1 培養后胚胎卵裂球是否增殖與妊娠結局的關系

與S1組相比，*P<0.01；與S0組相比，#P<0.01。

2.3 培養后2枚胚胎卵裂球的增殖情況或增殖百分比與妊娠結局的關系

在胚胎解凍培養后移植的S2組中，進一步發現妊娠率的變化趨勢分為3個區段，第一個區段(A區段)包含aa、ab、ac、ad組；第二個區段(B區段)包含bb、bc、bd組；第三個區段(C區段)包含cc、cd、dd組，此3個區段的妊娠率分別隨著各組內2枚胚胎中另一枚卵裂球增殖比例的降低而降低，其妊娠率差異有統計學意義(P<0.01)，；另外，3個區段的平均妊娠率之間差異有統計學意義(P<0.01)，見表2。

表2 培養后胚胎卵裂球的增殖情況或增殖比例與妊娠結局的關系

(續表2)

與aa組相比，*P<0.01；與bb組相比，#P<0.01；與cc組相比，△P<0.05。

2.4 Logistic分析結果

將本項研究納入的其他參數，即采卵時女方年齡、體質量指數(body mass index, BMI)、不孕年限及移植日內膜厚度作Logistic分析，結果提示女方年齡與妊娠顯著相關(P<0．05)，見表3。

表3 與臨床妊娠相關的多因素Logistic回歸分析結果

3 討 論

隨著胚胎玻璃化冷凍技術的日益成熟，玻璃化冷凍的胚胎復蘇率可達98%以上，使冷凍胚胎移植的妊娠率得到極大的提高[4]。影響胚胎種植的因素很多，其中胚胎質量是影響移植成功率非常重要的因素之一[5]。按照指南，胚胎質量可以從卵裂球數量、胚胎碎片、卵裂球均一性等角度進行評判，而與胚胎發育天數相符合的卵裂球數量又是影響胚胎質量評分的重要依據[3]。在FET操作中，延長解凍后胚胎的培養時間，可進一步觀察其發育潛能[6]，目前對于培養后胚胎質量的評價依然使用指南的靜態標準，缺乏反映其發育潛能的動態指標(如培養前后發育情況對比)，很難對培養后胚胎的發育潛能作出客觀的評判及進一步的移植胚胎選擇。本研究從培養后卵裂球數目的客觀依據出發，計算出培養前后胚胎卵裂球增殖的比例，分析該比例與妊娠結局的關系。

所有解凍的胚胎均為受精后72h的卵裂期胚胎，在其繼續生長的18～20h內有較明確的增殖狀態或者卵裂球增殖數目等客觀指標；納入研究的解凍后胚胎均為有≥50%卵裂球存活的復蘇胚胎，若有>50%卵裂球凋亡或溶解則判定為復蘇失敗，或培養后若出現逆分裂(reverse cleavage)或卵裂球數少于解凍后的情況，通常該情況會取消移植[7]。

本研究發現移植2枚胚胎均有卵裂球增殖的移植組(S2組)，其種植率、妊娠率均明顯高于只有1枚發育胚胎的移植組(S1組)和無卵裂球增殖組(S0組)，且流產率明顯低于S1及S0組；提示對復蘇后胚胎進一步培養觀察卵裂球是否增殖，對臨床冷凍復蘇周期的胚胎選擇具有參考意義。研究從解凍培養后胚胎卵裂球增殖比例的角度出發，發現臨床結局的變化趨勢明顯分為三個區段，在移植的2枚胚胎中至少有1枚發育到早期囊胚階段的A區段，無論與其一起移植的另一枚胚胎發育情況如何，均能獲得理想的臨床妊娠率及較低的流產率，提示了單囊胚移植的可行性；在移植的2枚胚胎中有1枚的卵裂球增值率>50%而未達到早期囊胚階段，另一枚增值率較其更低的B區段，也能獲得較好的臨床妊娠率，然而流產率卻隨著另一枚胚胎卵裂球增值率的下降而有所升高；最后，在移植的2枚胚胎中至少有1枚的卵裂球增值率在25%和50%之間或者<25%，另一枚增值率較其更低的C區段，臨床妊娠率進一步降低，在dd組，流產率甚至可高達50%。有研究[8]表明，人類胚胎在基因組激活主要發生在受精后發育第3天，在胚胎基因組激活后開始致密化形成桑葚胚，故復蘇24h仍無卵裂球增殖或低增值率的胚胎，其染色體異常率可達80%以上，這可能是本研究中流產率隨著胚胎卵裂球增殖率的下降而增高的原因。

由此可見，解凍后經培養18～20h的胚胎發育情況與妊娠結局相關，但還需增加樣本量來進一步研究論證。冷凍復蘇后的胚胎若能恢復胚胎良好的發育狀態，則預示其有較好的臨床結局。所以，通過延長體外培養時間，評估胚胎卵裂球的增值潛能，篩選出較優質胚胎，為臨床結局提供參考。