單細胞轉錄組測序分析人類胚胎發育阻滯的潛在機制

許常龍， 李春苑， 楊 華， 呂 波， 薛志剛，3， 丘 映

(1. 南寧市第二人民醫院生殖醫療中心，南寧 530031； 2. 同濟大學醫學院再生醫學系，上海 200092；3. 同濟大學附屬同濟醫院干細胞研究臨床轉化中心，上海 200065)

哺乳動物早期胚胎發育阻滯是進行胚胎體外培養中的普遍現象。人們在使用合成培養液培養不同動物的胚胎時發現，小鼠和大鼠在2細胞階段，兔和豬在4細胞階段，牛、綿羊等在8至16細胞階段，人類在卵裂期階段都會出現發育停止的現象[1]。哺乳動物的體外發育阻滯與三方面的因素有關，即： 胚胎種類、配子(卵子與精子)質量、體外培養環境(培養液成分與培養條件)[2]。研究者從不同角度對小鼠等動物的早期胚胎發育阻滯現象進行了研究，取得了很多進展[3]，但目前對人類胚胎體外發育阻滯的研究尚處于初步探索階段。人類早期胚胎發育是胚胎發育的關鍵階段，在這個過程中，胚胎中基因的轉錄和表達經歷了一系列巨大變化，包括受精后再程序化、基因組激活、細胞分化表觀遺傳狀態的轉換、X染色體失活等[4-5]。單細胞RNA-seq技術的出現為高精確地檢測和分析胚胎早期轉錄譜提供了前所未有的契機，該技術可以利用單個細胞作為樣本材料，全面、深入地分析轉錄組[6-7]。本課題利用單細胞RNA-seq技術，對南寧市第二人民醫院生殖醫療中心行體外受精(in-vitro fertilization, IVF)和胞質內單精子注射(intracytop-lasmic sperm injection, ICSI)術中的發育阻滯廢棄胚胎檢測其轉錄組情況，結合團隊前期數據[8]及Yan等[9]的植入前胚胎單細胞數據作為人類早期胚胎轉錄組的正常對照數據，研究和分析了人類早期胚胎發育阻滯的分子機制。

1 材料與方法

1.1 植入前胚胎分組

正常發育植入前胚胎單細胞數據來源于Yan等[9]及Xue等[8]的數據；阻滯胚胎數據來源于生殖中心廢棄胚胎(分為IVF組和ICSI組)，阻滯胚胎實驗通過南寧市第二人民醫院醫學倫理委員會批準(倫理號： KYXM201501)，并與正常胚胎發育比較，依據停滯發育時期的時間及細胞數量定義為原核期(Zygote)阻滯、2 cell阻滯、4 cell阻滯、8 cell阻滯、16 cell阻滯胚胎(表1)，經過單細胞轉錄組建庫、測序獲得。

1.2 方法

1.2.1 阻滯胚胎培養試劑、鑒定、收集和處理 胚胎體外培養試劑： Quinn,sAdvantageTM第三代HTF培養液(受精)；Quinn, sAdvantageTM卵裂培養液(卵裂期)；Quinn, sAdvantageTM囊胚培養液(囊胚培養)。

表1 阻滯胚胎分組情況統計

阻滯胚胎鑒定： 采集促排卵的卵子，在體外與精子進行IVF或ICSI完成受精，第2天觀察受精原核情況，第3、4天觀察胚胎卵裂情況，第5天觀察卵裂球融合情況。如果受精后胚胎在第3天仍處于原核期則列為Zygote阻滯；第4天起，第N天胚胎卵裂球數量與N-1天相同，則根據時間和卵裂球數量列為2 cell至16 cell發育阻滯。

胚胎活性鑒定： 胚胎操作人員會根據胚胎的發育，卵裂球是否完整、細胞膜是否破裂等來判斷胚胎是否已經死亡。

阻滯胚胎單細胞處理： 利用Tyrode酸將發育阻滯的胚胎透明帶消化掉，然后用0.25%胰酶將裸露的胚胎消化成單個細胞；利用單細胞轉移裝置將卵裂球轉移至裂解液中，準備下一步的單細胞建庫。

1.2.2 單細胞建庫方法 運用Smart-seq2單細胞轉錄組建庫方法[10]反轉錄成cDNA，其中0.1ng cDNA用于Nextera標記及文庫構建，利用Agilent Bioanalyzer 2100對上機文庫進行質量檢測，運用IlluminaHiseq 2500測序儀對文庫測序。

1.2.3 單細胞轉錄組測序及數據處理 測序完成后，用Casava1.8.2軟件將圖像格式的測序數據轉化為fastq格式，并根據每個樣品接頭上的分組信息從下機數據中分離每個樣品的測序數據；用Bowtie默認參數將讀長與hg38人類基因組參考序列比對，過濾掉在基因組上有多個比對位點和落在核糖體上的序列；用TopHat、Cufflinks等軟件計算比對在外顯子上reads的數量，并用每千個堿基的轉錄每百萬映射讀取的reads(reads per kilobase per million mapped reads, RPKM)值來表示基因表達高低。

1.2.4 加權基因共表達網絡分析(weighted gene co-expression network analysis, WGCNA) 采用R語言WGCNA軟件包[11]，參數設置參照文獻[8]： (1) 獲取單細胞轉錄組數據，構建所有檢測樣品中的所有基因之間的相關系數矩陣；(2) 提高基因共表達的量度構建鄰接矩陣，計算拓撲重疊，0.5+0.5X關系矩陣，軟閾值選取默認值β=12；(3) 基因高度相似的共表達關系組合，拓撲重疊上進行平均連接分層聚類；(4) 使用動態混合樹修剪算法削減層次聚類樹，定義模塊；(5) 把每個模塊的表達譜作為第一主成分進行歸納，合并特征基因高度相關的模塊。

2 結 果

2.1 阻滯胚胎單細胞聚類分析

通過NCBI數據庫胚胎、胚胎干細胞的單細胞數據收集，一共獲得153個正常單細胞樣本；通過生殖中心患者捐獻的廢棄發育阻滯胚胎，數據質控，一共獲得34個阻滯胚胎單細胞樣本。通過聚類分析，剔除異常單細胞轉錄組數據(圖1藍色方框Outlier)，結果顯示，阻滯胚胎各階段(圖1藍色橢圓框)合子期至4細胞期(zygote to 4-cell stage)、8細胞至16細胞期(8 to 16-cell stage)、囊胚期(blastocyst)都與正常發育的胚胎聚在一起。

圖1 阻滯胚胎與正常胚胎、胚胎干細胞ES的聚類圖Fig.1 Cluster dendrogram of arrested embryos, normal embryos and embryo stem cells

2.2 阻滯胚胎WGCNA分析

為了探究胚胎發生阻滯的可能原因，本研究通過WGCNA方法分析，使用默認參數進行分析，結果顯示包括阻滯胚胎在內各階段基因表達程序具有一定的保守性(圖2)。圖2上方的樹狀聚類把基因分成了多個模塊，通過模塊特征基因相關性檢測分析(圖3)，結果顯示pink等模塊在阻滯胚胎中具有非常高的相關性，但在正常胚胎中的相關性較低，即正常情況下負相關的表達趨勢的基因在阻滯的胚胎樣品中表現出正相關的表達趨勢。

圖2 WGCNA分析阻滯胚胎與正常胚胎各階段表達模塊Fig.2 Hierarchical cluster tree showing co-expression modules identified using WGCNA

圖3 阻滯、正常胚胎各階段模塊相關性分析Fig.3 Module-trait relationships between arrested and normal embryos

2.3 阻滯胚胎高相關性信號網絡及關鍵基因分析

通過篩選在阻滯胚胎中高相關性的pink模塊，對其深入分析發現其中包含30個基因，通過對這些模塊基因間作用網絡分析(圖4)，結果顯示，屬于蛋白激酶超家族的MKNK2基因處于較為中心的位置，其所編碼的蛋白處于MAP激酶下游，對于細胞內信號傳遞起著非常關鍵的作用。另一方面，對這些基因進行GO分析發現，這些基因富集在多個生物學功能，例如細胞代謝、細胞生長、蛋白定位等過程，見表2。

圖4 基因間作用網絡分析(阻滯胚胎vs正常胚胎)Fig.4 Module visualization of network connections and associated function(arrested embryos vs normal embryos)

2.4 IVF與ICSI技術對阻滯胚胎發育的影響

為進一步比較IVF方法和ICSI方法對胚胎發育阻滯的影響差異，本研究篩選了在兩組阻滯胚胎樣本間相關性存在差異的模塊，即在IVF組中相關性高于ICSI組的green模塊(圖3)，這個模塊包含29個基因，通過基因間作用網絡分析(圖5)，處于網絡中心的TUBB、CLDN7、YARS基因分別屬于微管蛋白構成、與緊密連接相關的膜蛋白、tRNA氨基酰化反應酶等，結合GO分析發現，green模塊基因主要參與了線粒體結構、內膜的合成、細胞骨架等生物學過程，提示IVF與ICSI技術可能會對胚胎發育潛能產生不同的影響，見表3。

表2 pink模塊基因GO分析

表3 green模塊基因GO分析

(續表2)

圖5 基因間作用網絡分析(IVF vs ICSI)Fig.5 Module visualization of network connections and associated function(IVF vs ICSI)

3 討 論

哺乳動物早期胚胎發育是一個復雜的過程，包括一系列重要的發育階段： 卵母細胞的成熟、受精和著床前胚胎發育。在基因表達、蛋白水平及表觀遺傳等方面也發生了一系列的變化： 母源RNA和蛋白質的降解以及胚胎自身的基因組激活、父源基因組的主動去甲基化、母源基因組的被動去甲基化、組蛋白的修飾變化等特征[12]。這些過程中任意關鍵信號通路或基因的擾動都有可能導致胚胎發育異常或者阻滯。在人類IVF過程中，受到環境、培養基、操作等一系列外界因素的干擾，胚胎發育阻滯的情況也會時常被觀察到。

本研究通過收集IVF和ICSI過程中的阻滯胚胎單細胞，構建單細胞轉錄組文庫，測序結果經過生物信息學分析，發現阻滯胚胎整體表達水平與各階段正常胚胎基本一致；然而通過WGCNA分析各階段關鍵模塊時，發現發育受阻胚胎與正常胚胎之間相關性相差較大。通過對高相關性模塊深入分析，發現阻滯胚胎的細胞代謝、細胞生長、蛋白定位等過程與正常胚胎之間存在差異，推測這些通路可能是胚胎發育阻滯的原因之一。本研究發現MKNK2基因在其中發揮了重要的功能，而該基因與雌激素受體ERβ有相互作用[13-14]，參與了胚胎發育、植入等重要過程[15]。PHF13編碼組蛋白去甲基化酶，可以參與調節染色體結構、影響基因的轉錄等，且與H3K4me2/3直接作用，影響細胞分化、分裂、DNA損傷修復、染色體結構等功能[16]。這些差異提示，在阻滯胚胎與正常胚胎之間從染色體、DNA等分子結構到細胞代謝等生物過程都存在差異，對于阻滯胚胎的治療手段研究應該更全面和深入。

本研究也分析了IVF過程和ICSI過程對胚胎發育阻滯的影響，發現在IVF組氧化磷酸化、線粒體膜結構等發生的變化較為顯著；這些結果提示IVF和ICSI技術會對胚胎細胞線粒體產生不同的影響，進而造成胚胎發育的阻滯。如線粒體分裂蛋白1(MTFP1)，調節線粒體分裂以及凋亡，進而對細胞活性產生影響[17]；Ndufc2基因編碼的NADH脫氫酶亞基，其缺失或者表達受阻會改變線粒體呼吸鏈復合物1的裝配和活性，并且影響線粒體膜電位和ATP含量，增加活性氧產量，進而影響細胞活性[18]。這些結果提示在輔助生殖過程中，選擇ICSI作為精卵受精手段時，還應該考慮這個過程對胚胎線粒體可能產生的影響，進而考慮ICSI中同時注射線粒體作為改善ICSI對阻滯胚胎發育影響的可能手段。

綜上所述，IVF過程中發生的胚胎發育阻滯現象受到多方面的因素影響，在阻滯胚胎中無論是細胞代謝、細胞間連接、線粒體結構和功能等都發生了變化。同時ICSI和IVF過程的不同也對阻滯胚胎的轉錄組產生了明顯的影響。這些結果為揭示IVF過程中胚胎發育阻滯的機制提供了線索和幫助，同時也為提高輔助生殖成功率、胚胎優生優育提供新的思路。