叔丁基對苯二酚對急性肺損傷小鼠的保護作用

陳冠楠，魏 娟，劉美云，周煥平，呂 欣

(同濟大學附屬上海市肺科醫院麻醉科，上海 200433)

急性肺損傷(acute lung injury, ALI)及其嚴重形式急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是臨床上常見的急危重癥。在過去的幾十年里，盡管人們對ALI的病因、發病機制和臨床防治等有了一定的認識，但ALI/ARDS患者的死亡率仍高達30%～50%[1]。炎癥反應平衡紊亂是ALI的主要原因[2]。因此，早期如何有效地干預過強的炎癥反應，阻止ARDS的發生，是目前該領域的研究熱點之一。

叔丁基對苯二酚(tert-butylhydroquinone, tBHQ)是一種合成酚類抗氧化劑,主要通過激活核因子E2相關因子2(nuclear factor E2-related factor 2, Nrf2)的表達來發揮抗氧化功能[3]。之前的研究報道了tBHQ在心、腦及肝臟組織損傷中通過抑制氧化應激反應發揮保護作用[4-5]。但tBHQ對ALI的作用尚不清楚。Nrf2是含有亮氨酸拉鏈結構的核轉錄因子，主要調控機體抗氧化應激反應[6]，已有研究表明Nrf2在ALI中發揮重要作用[7]，且Nrf2在先天性免疫反應調節中也起重要作用[8]。本研究通過脂多糖(lipopolysachride, LPS)腹腔注射建立小鼠ALI模型旨在探索tBHQ對炎癥反應調節和ALI的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本實驗采用6～8周無特異病原體(SPF)級C57BL/6J雄性小鼠98只，體質量19～21g，購自上海必凱實驗動物有限公司，飼養于同濟大學附屬上海市肺科醫院動物實驗中心，實驗動物在光照-黑暗交替(12h∶12h)，室溫維持在20～24℃，相對濕度50%～60%的飼養箱中適應性飼養1周。

1.2 實驗方法

1.2.1 LPS腹腔注射誘導ALI模型 將小鼠按照不同的實驗方案隨機分配為對照組(control組)、LPS組、磷酸鹽緩沖液(PBS)組、PBS/tBHQ組、LPS/tBHQ組、tBHQ+LPS/tBHQ組。配制不同濃度的LPS(美國Sigma公司)溶液(1mg/mL、2mg/mL)，直接腹腔注射誘導ALI模型[9]，LPS的劑量分別為低濃度10mg/kg和高濃度20mg/kg?？瞻讓φ战M不做任何處理。LPS組10或20mg/kg LPS腹腔注射，PBS組等體積腹腔注射，LPS/tBHQ組同時給予tBHQ與LPS，PBS/tBHQ組同時給予tBHQ與PBS，tBHQ+LPS/tBHQ組預先24h腹腔給予tBHQ并在LPS誘導時同時給予tBHQ。tBHQ(美國MedChem Express公司)腹腔注射劑量為50mg/kg[10]。按照實驗需求，分別觀察小鼠7d生存率，在不同的時間點(3、8、24h)取標本，進行下一步實驗。

1.2.2 樣本采集 LPS處理后不同時間點(3、8、24h)分別用眼球取血的方法采集小鼠外周血，置于4℃冰箱靜置2h后，離心半徑15cm，5000r/min，4℃，離心10min，吸取上清液分裝，-80℃保存備用。眼球取血后頸椎脫臼處死小鼠，取左肺置于4%多聚甲醛固定液中固定、脫水、平鋪包埋最大面用來病理學檢測，右肺置于1mL TRIzol中提取RNA，實時定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測肺組織中目的基因的mRNA水平。

1.2.3 血清中的IL-6、TNF-α及IL-10的檢測 采用多重液相蛋白定量技術即CBA法檢測LPS處理后不同時間點(3、8、24h)血清中細胞因子的變化(IL-6和TNF-α)以及LPS處理后3h時血清中IL-10的變化。利用Accuri C6型流式細胞儀(美國Becton-Dickinson公司)，在488nm(藍色)和640nm(紅色)的條件下，檢測微球的位置和熒光信號強度。血清中的抗體以熒光強度均值為基礎，轉化為濃度(ng/L)。

1.2.4 RT-qPCR檢測目的基因表達 提取肺組織總RNA，按照日本TaKaRa公司Prime Script RT reagent Kit反轉錄試劑盒說明書進行37℃反轉錄15min，85℃轉錄酶滅活5s，4℃反應終止。目的基因的表達采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ和ABI 7500 PCR系統檢測，運用相對定量法比較不同組IL-6、IL-10和TNF-α的mRNA水平差異，以β-actin作為內參，表達差異的計算為2-ΔΔCt。β-actin上游引物5′-AGTGTGACGTTGACATCCGT-3′，下游引物5′-GCAGCTCAGTAACAGTCCGC-3′；IL-6上游引物5′-TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC-3′，下游引物5′-TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC-3′；TNF-α上游引物5′-AAGCCTGTAGCCCACGTCGTA-3′，下游引物5′-GGCACCACTAGTTGGTTGTCTTTG-3′;IL10上游引物5′-GCTCTTACTGACTGGCATGAG-3′,下游引物5′-CGCAGCTCTAGGAGCATGTG-3′。

1.2.5 Western印跡法檢測Nrf2蛋白的表達 LPS處理后3h，處死小鼠，提取肺組織，按試劑盒步驟提取組織核蛋白，蛋白定量采用BCA蛋白定量試劑盒。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，轉膜，孵育Nrf2特異性一抗(1∶1000,12721S,美國CST公司)，相應二抗孵育后，洗膜，化學發光顯色分析各組中Nrf2蛋白的表達情況，以核內蛋白Lamin A/C(1∶1000;sc-376248,美國Santa Cruz公司)為內參。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 各組小鼠7d生存率比較

小鼠給予低劑量LPS(10mg/kg)腹腔注射，7d內生存率為80%。LPS/tBHQ組和tBHQ+LPS/tBHQ組小鼠的7d生存率均有提高，均為100%，但差異均無統計學意義(與LPS組相比，P=0.3713)，見圖1A。當小鼠給予高劑量的LPS(20mg/kg)時，2d 內全部死亡；而LPS/tBHQ組小鼠的7d生存率為60%(與LPS組相比，P=0.0005)；tBHQ+LPS/tBHQ組小鼠的7d生存率為100%(與LPS組相比，P=0.0001)，見圖1B。因此，隨后的實驗中將使用非致死LPS劑量10mg/kg，探究tBHQ的潛在保護作用。

圖1 小鼠7d生存率(n=8)Fig.1 The mortality of mice treated with(n=8)A： 低劑量(10mg/kg)LPS腹腔注射；B： 高劑量(20mg/kg)腹腔注射

2.2 LPS組不同時間點小鼠肺組織和血清中IL-6和TNF-α水平檢測

上述結果顯示,ALI小鼠的死亡主要是集中在LPS后48h內。肺組織中促炎細胞因子IL-6和TNF-α的mRNA水平在LPS處理后3h時最高，隨著時間的增加逐漸下降，見圖2A、2B。此外，血清中IL-6和TNF-α的濃度變化是一致的，見圖2A、2B。因此，本研究將LPS處理后3h作為后續研究的時間點。

圖2 LPS單獨處理后不同時間點小鼠肺組織和血清中IL-6(A)和TNF-α(B)水平變化Fig.2 LPS induced changes of the IL-6(A) and TNF-α(B)in the mouse lung tissues and serum與control組相比,*P<0.05;**P<0.01;n=6

2.3 各組小鼠肺組織病理檢查結果

H-E病理學檢查結果顯示，與空白對照組相比，PBS不會引起肺組織病理損傷；LPS處理3h后，小鼠肺組織出現嚴重損傷，正常肺泡結構減少，炎癥細胞浸潤及肺泡間隔增厚。而LPS/tBHQ組和tBHQ+LPS/tBHQ組小鼠肺組織的損傷程度均明顯減輕，見圖3。

2.4 各組小鼠各因子在肺組織及血清中表達情況

與空白對照組相比，LPS腹腔注射3h后，LPS組小鼠肺組織中的炎癥因子IL-6(P=0.0004)和TNF-α(P=0.0002)的mRNA水平明顯升高，見圖4A；與LPS組相比，LPS+tBHQ組小鼠肺組織中IL-6(P=0.036)和TNF-α(P=0.0002)mRNA水平明顯降低，同時，tBHQ+LPS/tBHQ組小鼠肺組織中IL-6(P=0.009)和TNF-α(P=0.0002)mRNA水平也明顯降低(圖4A)。與空白對照組相比，LPS處理3h后肺組織中抗炎因子IL-10的mRNA表達升高(P=0.0005)，而與LPS組相比，LPS+tBHQ組和tBHQ+LPS/tBHQ組小鼠肺組織中IL-10的mRNA水平均明顯升高(P分別為0.0002和0.0003)，見圖4A。同樣地，小鼠血清中炎癥因子IL-6和TNF-α的濃度水平變化與肺組織中mRNA水平變化一致，而t小鼠血清中抗炎因子IL-10的濃度變化也與肺組織中mRNA水平變化一致，見圖4B。

圖3 LPS腹腔注射3h后各組小鼠肺組織病理切片(H-E,×100)(n=6)Fig.3 Lung tissue sections were prepared at 3h after LPS injection and stained with hematoxylin-eosin(H-E,×100)(n=6)

圖4 小鼠肺組織和血清中IL-6、TNF-α及IL-10的表達Fig.4 Expression of lL-6, TNF-α and IL-10 in lung tissues and serum*P<0.05;**P<0.01;n=6

2.5 各組小鼠肺組織Nrf2 mRNA表達情況

與對照組相比，單純tBHQ處理沒有增加肺組織Nrf2的mRNA水平(P=0.565)，見圖5A；LPS處理3h時可明顯降低肺組織中Nrf2 mRNA水平(P=0.010)，tBHQ與LPS同時處理與LPS組相比，Nrf2 mRNA水平明顯升高(P=0.011，圖5A)。Western blot結果顯示，單純tBHQ處理與對照組相比，明顯增加核內Nrf2蛋白表達(圖5B)；單純LPS處理組與對照組相比，核內Nrf2蛋白表達減少，而tBHQ與LPS同時處理組可明顯增加核內Nrf2蛋白水平，見圖5B。

圖5 RT-qPCR和Western印跡法檢測肺組織中Nrf2水平Fig.5 Levels of Nrf2 in lung tissues were detected by RT-qPCR and Western blotting*P<0.05;n=6

3 討 論

ALI和ARDS是由多種原因導致的急性呼吸功能障礙，ARDS患者的主要病理表現為彌漫性肺泡損傷,肺透明膜形成、肺泡蛋白水腫液，過度的炎癥細胞和炎癥細胞因子的釋放[11]。目前，ARDS確切的發病機制尚不清楚。大量的研究證明，機體失控的全身炎癥反應，過度活化的細胞免疫和體液免疫反應，往往導致細胞損傷和死亡，參與ARDS的發病過程[12]。盡管目前多種支持治療策略有了很大的進展，但ARDS病死率仍居高不下[13]。本研究結果表明LPS誘導前24h使用tBHQ并同時LPS腹腔注射時再次使用和LPS誘導時同時給予tBHQ可顯著降低LPS誘導的ALI小鼠死亡率，減輕肺組織損傷，明顯減少肺組織和血清中促炎細胞因子的表達(IL-6和TNF-α)，同時增加抗炎細胞因子(IL-10)表達。此外，tBHQ還可拮抗小鼠肺組織中LPS對Nrf2核轉位的抑制。

抗氧化劑tBHQ在多種細胞和組織損傷中發揮保護作用，減輕氧化應激損傷導致的細胞功能障礙[14]。本實驗探討了tBHQ對ALI小鼠的作用，結果表明，tBHQ能顯著降低高劑量LPS腹腔注射誘導的ALI小鼠死亡率，且小鼠死亡主要集中在急性期。據此，本研究檢測了LPS處理早期不同時間點(3、8、24h)下小鼠肺組織和血清中炎癥因子水平(IL-6和TNF-α)，結果表明小鼠肺組織或血清中炎癥因子水平隨著時間的推移逐漸降低。ARDS急性炎癥早期常表現為“炎癥因子風暴”，主要是固有免疫發揮作用，炎癥細胞早期釋放促炎細胞因子清除病原菌，后期則通過分泌抗炎細胞因子促進組織修復，拮抗過強的炎癥反應[15]。隨著研究的不斷深入，單一的阻斷細胞因子、病原體識別或炎癥信號通路等治療ARDS的臨床試驗均以失敗告終[16]，研究免疫平衡調節，已成為探究ALI/ARDS發生、發展以及治療的重要途徑。

本研究結果顯示，tBHQ通過下調肺組織和血清中促炎基因IL-6和TNF-α的表達以及上調抗炎基因IL-10的表達來調節ALI小鼠的炎癥反應平衡，從而減輕ALI小鼠的肺組織損傷。ARDS急性炎癥早期，活化的免疫細胞釋放大量的促炎細胞因子(如IL-6、IL-12和TNF-α等)清除病原菌[17]，同時抗炎細胞因子(IL-10)拮抗炎癥反應，減輕組織損傷[16]。細菌感染和內毒素誘導激活多種免疫細胞異常分泌趨化因子和細胞因子，通過激活經典Toll樣受體4(TLR4)信號通路激活核因子NF-κB，誘導炎癥級聯瀑布反應，最終導致全身炎癥反應，并引起肺組織嚴重損傷[18]。因此，ARDS急性期控制機體異常免疫反應，調節機體促炎、抑炎反應平衡將有助于治療ARDS，改善ARDS的治療前景。

此外，tBHQ單獨給予未增加小鼠肺組織中Nrf2 mRNA水平，但可促進肺組織中Nrf2的核轉位。在LPS誘導的ALI急性期(3h)時，LPS不僅抑制肺組織中Nrf2 mRNA的水平同時也抑制其核轉位，與已有的研究一致[19]。而給予小鼠LPS誘導后同時tBHQ處理，不僅可增加肺組織中Nrf2的mRNA水平也可促進Nrf2的核轉位。這些結果表明，tBHQ降低ALI小鼠死亡率，調節小鼠體內抗炎、抑炎反應，進而減輕ALI可能與促進Nrf2核轉位有關。tBHQ可激活抗氧化反應元件和上調Nrf2的表達來減輕神經系統損傷[4]。tBHQ還可增加Nrf2蛋白穩定性，激活Nrf2核轉位發揮抗氧化功能。Nrf2作為一種含亮氨酸拉鏈結構的核轉錄因子，不僅調控機體抗氧化應激反應、促進細胞保護性基因的轉錄[6]，同時還在ALI中發揮抗炎作用[7]。本研究表明，tBHQ可能通過激活Nrf2，促進其核轉位，降低ALI小鼠死亡率，減輕其肺組織損傷程度，調節炎癥免疫平衡。然而，tBHQ的抗氧化應激作用不能被排除，仍需更進一步的研究。

綜上所述，通過腹腔注射LPS建立ALI小鼠模型，tBHQ可降低ALI小鼠的死亡率，抑制促炎細胞因子的表達，促進抗炎細胞因子的表達，顯著減輕肺組織損傷，其機制可能與促進Nrf2核轉位有關，為臨床預防和治療ALI提供了新的思路。