不同濃度人脂肪干細胞與脂肪顆粒混合種植對裸鼠脂肪細胞增長的影響

柳幸子， 全 紅， 劉君君， 韓 晶

(1. 同濟大學醫學院，上海 200092； 2. 同濟大學附屬東方醫院乳腺外科，上海 200120)

自2003年日本吉村浩太郎(Yoshimura)[1]提出細胞輔助脂肪移植技術(cell-assisted lipotransfer, CAL)，即將自體脂肪中分離的新鮮基質血管組分(stromal vascular fraction，SVF)與移植脂肪混合移植，該移植術就在臨床上得到了廣泛的應用。有研究[2]證實SVF中人脂肪干細胞(adipose-derived stem cells, ADSC)對促進脂肪生長起了關鍵作用，但加入多少ADSC會使脂肪的成活量最佳，仍不明確[3]。Li等[4]將脂肪來源基質細胞和富血小板血漿共同培養24h，證明了富血小板血漿與濃度為1×105mL/200μL ADSCs混合時能降低脂肪吸收縮小。在國內研究[5-7]中，因為SVF制作較為簡單，大多數實驗研究的是新鮮分離的SVF與脂肪混合時的最佳濃度，即使它們含有其他細胞，也仍將其中含有的ADSCs移植入受區脂肪中。因此，對于某些手術，可以犧牲ADSCs的純度使部分外科手術更加簡便，而對于另一些手術，進行脂肪干細胞體外擴張是必需的，因為擴張可以產生實現治療結果所需的細胞數量，特別是ADSCs可能作用于全身各部位[8-15]的手術。為了獲得臨床相關的ADSCs產量，需要3～5周的培養周期，所以本研究更加關注的是單純ADSCs對輔助脂肪生長的作用。單純ADSCs的提取所需的脂肪相較于分離SVF少，且細胞數量可控制。本研究觀察比較不同濃度的ADSCs對移植脂肪顆粒成活的作用，評價其有效性，旨在探索一種更精準、有效的細胞輔助脂肪移植方法，以期為臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物

健康雌性BALB/c裸鼠8只，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，6～8周，清潔級，體質量25～29g，裸鼠專用飼料喂養。動物飼養于上海市東方醫院實驗動物中心。

1.2 試劑與儀器

DMEM/F12培養基、0.25%胰蛋白酶．EDTA消化液購自美國Hyclone公司；特級胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司；aFGF因子購自美國PEPROTECH公司；注射用青霉素鈉購、注射用慶大霉素、肝素鈉均購自中國華北制藥集團股份有限公司；膠原酶I購自美國Solarbio公司；PBS由同濟大學附屬東方醫院檢驗科提供；10mL細胞培養瓶購自美國COSTAR公司；CO2恒溫培養箱購自中國上海Lishen科學儀器有限公司；超凈工作臺購自中國蘇州福華凈化設備有限公司；臺式離心機購自日本久保田公司；電子天平購自上海精密科學儀器有限公司天平儀器廠；Finnpipette微量移液器購自美國賽默飛世爾儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 人脂肪干細胞的分離培養 自上海市東方醫院乳腺外科手術患者的皮下獲取500mg脂肪組織，再將脂肪組織一次擠壓入15mL離心管中，共3支，每個離心管中的組織5mL。加入PBS緩沖液7mL，吸管吹打10～20次，靜置1min，用吸管將組織下層的液體吸出。如此反復直到所吸出的液體呈透明狀，不帶有血細胞為止。向脂肪組織試管中加入5mL消化液(0.25%胰酶，0.1%Ⅰ型膠原酶，以1∶1混合)，密封試管，37℃恒溫搖床，190r/min，振蕩消化30min。此時液面分為3層，上層為黃色油狀脂肪細胞層，中層為脂肪組織層，下層為含單個核細胞的液體。吸出離心管中的下層液體移入含完全培養液(含10%胎牛血清的高糖DMEM)的新離心管中終止消化，然后將離心管封閉，1500r/min，離心半徑11cm，離心10min；去掉上清液后，加入1mL培養基，輕輕吹打10～20次制成細胞懸液，收集各個離心管中的細胞懸液，接種待用。在剩余脂肪中加入新的胰酶和膠原酶，重復以上步驟繼續消化，重復2～3次，將收集到的有核細胞按照一定的密度接種到培養瓶中，放入37℃、5% CO2培養箱培養。12～24h后，觀察到細胞貼壁即可進行第1次換液，此后每隔3d換液，待細胞生長至融合后進行傳代。

1.3.2 人脂肪干細胞鑒定 (1) 成脂誘導及檢測。選取第3代細胞,用胰液消化后,接種到置有蓋玻片的6孔培養板上,每孔105個細胞,在37℃、5% CO2條件下培養過夜。待細胞貼壁后,將培養基更換為成脂誘導培養液(高糖DMEM, 20% FBS,100U·mL-1青霉素,100U·mL-1鏈霉素,1μmol·L-1地塞米松,10μmol·L-1胰島素，0.15mmol·L-1IBMX,200μmol·L-1吲哚美辛),每周換液2次,同時設立對照組，只加入對照培養液(高糖DMEM,20% FBS,100U·mL-1青霉素,100U·mL-1鏈霉素)。培養2周后,分別取對照組和誘導組細胞進行油紅O染色以證實細胞中是否有脂滴形成。(2) 骨誘導及檢測。選取第3代細胞,以每孔1×105個細胞接種到置有蓋玻片的6孔板中,37℃孵育24h。待細胞貼壁后,加入成骨誘導培養液(高糖DMEM, 20% FBS,100U·mL-1青霉素,100U·mL-1鏈霉素,10mmol·L-1β22磷酸甘油,1μmol·L-1地塞米松,50mg·L-1抗壞血酸磷酸鈉),每周換液2次,并設立只加入對照培養基的孔為對照組,72h 后進行AKP含量測定,8d后進行茜素紅染色。AKP(U·g-1)=測定管吸光度/標準管吸光度×標準管含酚的量/取樣量中蛋白克數。(3) 免疫組化染色。選取第3代細胞,2%胰酶消化,接種于置有蓋玻片的6孔板,37℃、5% CO2培養箱培養至貼壁,進行免疫組化染色。

1.3.3 脂肪顆粒凍存與復蘇 取該患者的脂肪組織20g用鋒利剪刀剪為約0.1cm×0.1cm×0.1cm大小的脂肪顆粒，置入無菌的20mL注射器中，生理鹽水沖洗，靜置法純化后分別置于凍存管中，加入等體積防凍劑15%二甲基亞砜(DMSO)。凍存管消毒，封口，標記，0℃ 15min，再放入液氮罐中保存。脂肪顆粒注射時，取出凍存管，立即置入37℃恒溫水浴槽中解凍，快速晃動，待完全溶解，肉眼觀察外觀變化后，立即去除防凍劑。

1.3.4 脂肪顆粒移植 將進行過細胞計數后的脂肪干細胞與復蘇后的脂肪顆粒0.5mL混合分別注入8周齡裸鼠左右兩邊背部筋膜下，脂肪干細胞濃度分別為A組每200μL脂肪1×106個；B組每200μL脂肪1×105個；C組每200μL脂肪1×104個。設置對照組；D組單純脂肪顆粒0.5mL進行對照。每組2只。觀察并于移植6周后取材，形態學及分子生物學檢測比較各組形成的脂肪標本。

1.3.5 實驗結果檢測

大體測量用游標卡尺每2周對脂肪團塊長短徑進行測量。6周后處死裸鼠，從皮下取出移植的脂肪，用10%甲醛固定，石蠟包埋，用蘇木精和伊紅(H-E)染色，進行組織學分析。

CD31免疫組化染色分析移植脂肪的血管化情況。Hoechst 33342核酸染色進行對比染色。用X-Cite 120熒光成像系統(×40)做染色切片成像。在高倍視野像素較好的區域下，用Image J給CD31染色定量。免疫組化以胞漿或胞膜棕黃色顆粒狀沉積為陽性。先按陽性細胞比例將無、1%～25%、26%～50%、51%～75%、76%～100%分別計為0～4分；再按染色強度將無、弱、中、強分別計為0～3分，最后綜合兩部分得分。A組： 4+2=6分；B組： 3+2=5分；C組： 3+2=5分；D組： 2+1=3分。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 人ADSCs培養

第4代ADSCs 20X生長狀況良好，具有明顯的方向性，見圖1。

圖1 第4代人脂肪干細胞Fig.1 The fourth generation of ADSCs

2.2 人脂肪干細胞鑒定

成脂誘導2周后,胞內開始出現脂滴,誘導組及對照組分別進行油紅O染色,成脂誘導組油紅O染色陽性,對照組為陰性。成骨誘導72h后,對照組及誘導組分別進行AKP含量測定。對照組AKP含量為0.1632U·g-1,誘導組AKP含量為0.1488U·g-1,誘導組AKP含量明顯高于對照組,兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)。成骨誘導8d后,對照組及誘導組分別進行茜素紅染色,誘導組染色陽性,對照組為陰性。

第3代細胞進行免疫組化染色結果顯示，培養細胞有CD44、CD49d抗原陽性表達,不表達CD45、CD106抗原。證明該細胞為人脂肪干細胞，具有成脂性。

2.3 觀察期間移植脂肪顆粒大小測量

觀察期間測量脂肪顆粒長短徑，4組的移植脂肪顆粒長短徑變化不明顯，且范圍均在0.1cm內，而D組在第6周時長徑呈明顯下降趨勢，見表1。

表1 移植術后6周內脂肪顆粒長徑

2.4 移植脂肪顆粒重量的測量

術后6周，A、B、C、D組脂肪移植物濕重分別為(0.288±0.06)、(0.348±0.06)、(0.238±0.06)和(0.207±0.06) g，A、B、C組移植脂肪組織濕重明顯高于D組，且B組最高，各組間差異均有統計學意義(P<0.01)。

2.5 H-E染色

石蠟包埋，組織切片后行H-E染色，圖像顯示B、C組脂肪形態較好，排列較緊致，A組纖維結締組織較多，D組存在脂肪變性壞死，見圖2。

2.6 CD31免疫組化染色

CD31是表達于血管內皮細胞上的一種黏附分子，作為血管鑒定標記具有較好的特異性。脂肪移植物的CD31免疫組織化學染色結果提示： 免疫組化染色顯示B組染色強，微血管密度大，A、C、D組均顯示較弱，見圖3。

圖2 H-E染色Fig.2 Section stained with H-EA組： 切面顯示血管豐富，纖維結締增生組織較多。脂肪細胞排列不均勻；B組：切面顯示血管豐富，脂肪細胞飽滿排列緊密；C組： 切面可見血管，脂肪細胞也較飽滿，生長情況不如B組；D組： 大部分為增生的纖維結締組織，可見纖維囊泡組成，血管分布較少；紅箭頭代表血管組織，黑箭頭代表纖維組織，白箭頭代表脂肪細胞

圖3 免疫組化Fig.3 Immunohistochemical sectionA組評分6分；B組評分5分；C組評分5分；D組評分3分

3 討 論

隨著社會的進步及醫學的蓬勃發展，醫療美容現已成為時下最熱門的專業之一。自體脂肪移植技術也應運而生。20世紀以來，自體脂肪組織移植已經應用于人體軟組織缺損的重建。在傳統的脂肪組織移植中，平均吸收率為25%～80%。研究發現，影響移植脂肪組織吸收率的因素包括： 移植脂肪組織的數量和體積、移植脂肪細胞的活性、純度以及受區的血供情況等。脂肪細胞耐受缺氧能力差，故因在移植的最初時期，受區血液供應及毛細血管系統尚未建立，多數脂肪細胞在最初的48h內即發生變性和壞死。近幾年，整形外科的技術在不斷地創新，隨著多能干細胞的問世，脂肪移植術又重新被專家學者探討。自日本吉村浩太郎提出CAL，又重新打開了脂肪移植術運用于臨床的大門。實驗[16]表明，脂肪來源干細胞能夠耐受缺氧，并且在缺氧條件的刺激下，通過直接分化為受損細胞，旁分泌各種細胞因子，調節炎癥和免疫反應，促進血管新生，修復受損組織。而近期的研究[17]多認為，脂肪干細胞主要通過旁分泌機制發揮作用，而非直接分化替代受損細胞。因此，通過脂肪干細胞輔助自體脂肪移植，可以有效預防脂肪移植并發癥的發生，如脂肪壞死、囊腫形成和脂肪鈣化。目前，新鮮SVF組織在1期手術中經過分離、純化后與自體脂肪混合已廣泛應用于臨床。大量文獻中臨床手術及預后數據證明SVF/ADSCs對提高自體脂肪移植術后的脂肪存活率是有臨床意義的。并且有學者提出，脂肪干細胞對脂肪組織的正向作用是有劑量依賴性的。脂肪干細胞在脂肪移植術中的劑量存在一個最佳比例，使脂肪細胞的生長起到最佳作用。

有研究[18]證明，來源于人自體SVFs復合脂肪顆粒的濃度為1×106個/mL數量級時，能夠有效提高移植脂肪的存活率。該實驗提出，SVF中的ADSCs起到了主要作用。SVF中35%的有核細胞為ADSCs。本研究制備自人脂肪來源的3種不同濃度ADSCs與自體脂肪顆粒復合移植，結果表明，ADSCs能夠明顯改善移植脂肪組織成活的微環境。有研究[19]顯示，臨床術后6～8周ADSCs的移植活性最強，所以本研究選擇在移植后6周進行觀察。在移植后觀察期間，4組的移植脂肪顆粒長短徑變化不明顯，而D組在第6周時長徑呈明顯下降趨勢。組織隨著移植時間的增加，優先出現衰敗跡象。移植術后6周后觀察，實驗A、B、C組在濕重、移植脂肪成活率、血管化效應較對照D組高，且B組在濕重、脂肪存活率及血管化效應明顯高于其他3組，纖維壞死率明顯低于其他組。實驗證實了每200mL脂肪顆粒中含1×105個脂肪干細胞時在一定空間和時間內更能提高相應移植脂肪組織存活率及促進有效新生血管生成。本研究認為，C組脂肪移植物中脂肪細胞部分壞死、纖維組織增生明顯，其重要的原因可能與ADSCs的含量相對較少有關。ADSCs數量較少，分泌因子及生成血管較少，會影響其替換進程，術后可出現移植脂肪萎縮。實驗結果還表明A組每200mL脂肪ADSCs達1×106個時，脂肪生長并未能達到預期效果。有研究[20]表明在體外環境下，巨噬細胞的分泌物可有效地抑制ADSCs的成脂分化，過多的巨噬細胞在體內移植物中可能也會產生類似的效果。脂肪干細胞在體內缺氧環境中胞可以分泌一系列細胞因子和生長因子到周圍組織液中，調節組織微環境，形成有利于干細胞生長的微環境。其中包含細胞趨化因子： 單核細胞趨化蛋白l和2、巨噬細胞集落刺激因子[21]。本研究認為當脂肪干細胞濃度過高時，可能分泌大量巨噬細胞，對ADSCs的成脂分化產生抑制作用。再加上ADSCs可以分化成血管內皮細胞和血管壁細胞，當濃度過高時，脂肪干細胞大量分化，占取了脂肪顆粒所需養分，且生長空間有限，導致脂肪干細胞不能及時成脂化。但因本實驗觀察期間不夠長，并不排除高濃度的脂肪干細胞在更長時間體內生長過后能達到較好的效果。根據移植物H-E染色及免疫組化顯示，A組結締組織成分較多，血管豐富，但是脂肪細胞較少，認為過多的脂肪干細胞，雖能促使大量的血管形成，但因生長競爭抑制脂肪細胞的生長，造成纖維結締組織增生過度。綜上可以看出，脂肪干細胞可通過分化成血管內皮細胞和血管壁細胞，促進脂肪組織內的血管再生，有助于移植脂肪組織的存活。并且在缺氧刺激和其他條件下釋放血管生長因子，誘導移植脂肪周圍的組織血管發生。提高移植脂肪的ADSCs比例，可避免移植脂肪組織過早吸收壞死，而過高濃度的脂肪干細胞因生長競爭抑制脂肪細胞的生存率，且分泌的大量巨噬細胞間接抑制了脂肪干細胞的成脂分化。因此，在移植過程中，適當濃度的脂肪干細胞是必須的。

總之，體外提純培養的脂肪干細胞所需脂肪組織相較于SVF更少，并且可通過培養傳代獲得手術所需細胞數量。相信隨著精準醫療的發展，體外培養純化的ADSCs混合脂肪移植術會因其可定量檢測注射及獲取方便的優點而被廣泛應用。