DNA羥甲基化酶TET1對良性前列腺增生細胞的增殖調控作用及其機制

徐成黨， 黃盛松， 錢多成， 吳登龍

(同濟大學附屬同濟醫院泌尿外科，上海 200065)

良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia, BPH)常被稱為前列腺增生，多見于中老年男性患者，是最為常見的導致排尿障礙的良性疾病，主要是前列腺中異常增生的組織造成膀胱出口的機械性梗阻(bladder outlet obstruction, BOO)，引起下尿路癥狀(lower urinary tract symptoms, LUTS)并伴隨不同程度的排尿困難，排尿費力等主要臨床癥狀[1]。前列腺增生不是彌漫性增生，而是移行帶區域的過度增生[2]。前列腺增生的發病機制仍未完全清楚，目前認為老齡和雄激素是發病的必要條件。有報道前列腺體積大小和體內雙氫睪酮(DHT)水平呈正比，而與睪酮(T)無關。DHT在體內Ⅱ型5α-還原酶的作用下由睪酮轉化而來[3]，而Ⅱ型5α-還原酶的表達受其調控基因SRD5A2啟動子區域甲基化水平的影響[4]。甲基化是一個動態可調控的過程，其受去甲基化酶的影響，DNA羥甲基化酶TET1能夠發揮調控SRD5A2表達的作用[5-6]。本研究擬探討TET1在前列腺增生過程中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 標本來源

選取2016年5月至2017年9月期間就診于同濟大學附屬同濟醫院泌尿外科因前列腺特異性抗原(PSA)升高行前列腺穿刺、因前列腺增生行前列腺電切、因膀胱癌行根治術患者，收集其前列腺標本，按前列腺大小分為A、B和C三組[7]： A組(前列腺體積V<30mL)11例，前列腺體積(21±5) mL,其中膀胱癌根治術6例，因PSA升高行前列腺穿刺5例；B組(30mL≤V≤70mL)34例，前列腺體積(47±11) mL,其中前列腺穿刺24例，前列腺增生行電切10例；C組(V>70mL)27例，前列腺體積(96±13) mL,其中前列腺穿刺10例，前列腺電切17例。所有病例均在直腸B超引導下經會陰前列腺穿刺分別取外周帶和移行帶組織各3條，分別用來進行免疫組化和定量聚合酶鏈反應(qPCR)檢測外周帶和移行帶TET1和SRD5A2的表達，酶聯免疫吸附實驗(ELISA)檢測組織中DHT水平。本研究中涉及到的所有病例標本來源均獲得同濟大學附屬同濟醫院倫理委員會批準和患者及家屬知情同意。

1.2 病例入組標準和排除標準

入組標準： 所有病例取材均經病理證實為前列腺增生和不增生組織，排除前列腺炎和前列腺癌，膀胱癌根治標本證實無前列腺侵犯轉移，所有病例隨訪6個月無前列腺癌。排除標準： 取樣前6個月內服用過5α-還原酶抑制劑及其他激素類藥物，近期有泌尿道感染、尿常規異常、留置導尿病史者。

1.3 材料及主要試劑

人正常前列腺上皮細胞RWPE-1購自北納科技有限公司，KSFM細胞培養基購自美國Hyclone公司。抗體TET1、SRD5A2、5-MC購自美國Abcam公司，細胞凋亡檢測試劑盒和細胞增殖CCK-8檢測試劑購自美國Sigma公司，ELISA檢測DHT試劑盒購自上海同進生物科技有限公司，其他試劑及材料來自同濟大學附屬同濟醫院中心實驗室。TET1基因功能區序列上游引物5′-AGCTGGATTGAAGGAACAGG-3′，下游引物5′-GTCTCCATGAGCTCC-CTGAC-3′。

1.4 組織免疫組化、qPCR檢測

所有病例穿刺后外周帶和移行帶標本各取2條，其中1條送至病理科，進行免疫組化檢測TET1、Ⅱ型5α-還原酶和甲基化狀態(5-mc)。另外1條利用TRIzol法提取RNA進行PCR檢測TET1和SRD5A2的mRNA表達量。

1.5 前列腺組織免疫組化染色結果判定方法

免疫組化染色后，觀察TET1及Ⅱ型5α-還原酶在不同區帶及不同類型細胞中的分布差異，同時比較相應部位的甲基化狀態。染色結果由2位病理科醫生雙盲閱片判定，光鏡下觀察細胞染色程度和范圍，讀片后按細胞顯色強度及比例評分，每張切片隨機讀取5個視野(×400)。評分標準： 不著色為0分(-)，淺黃色為1分(+)，棕黃色為2分(++)，棕褐色為3分(+++)；陽性細胞百分比<5%為0分，5%～25%為1分，25%～50%為2分，>50%為3分，兩者乘積的積分>3分為陽性，見表1。

表1 免疫組化染色

1.6 ELISA法檢測組織中DHT含量

收集到的標本立刻存入-80℃冰箱防止DHT降解。樣本解凍后磨成勻漿，離心半徑4cm，2000r/min，離心10min后收集上清液，用試劑盒進行檢測(重復3次)，檢測過程中稀釋5倍。

1.7 細胞培養

Rwpe-1細胞生長于KSFM培養液，置37℃、100%飽和濕度、5% CO2的培養箱中培養。細胞呈單層貼壁生長，融合度達80%～90%時進行常規傳代。

1.8 利用轉染干擾和過表達Rwpe-1細胞TET1基因

轉染前1d收集融合度為80%的Rwpe-1細胞，用KSFM培養液調整其密度為1×105/mL，將細胞以1×105/孔接種于6孔板(2mL/孔)中，當細胞在24h內融合達60%～80%時進行轉染。采用陽離子脂質體Lipofectamine 6000，按試劑盒說明書進行轉染。實驗分3組： 對照組(Ctrl組),過表達組(TET1-OE組)，敲減組(TET1-KD組)。轉染的細胞用于后續的CCK-8法細胞增殖、周期、凋亡、蛋白印跡和qPCR檢測。

1.9 轉染后TET1和SRD5A2基因mRNA表達及蛋白質水平檢測

轉染24h后TRIzol法提取總RNA，反轉錄得到cDNA，再進行PCR擴增，反應條件如下。95℃預變性1min，95℃ 15s，60℃ 30s，72℃ 45s，40個循環，72℃ 5min。計算各組間TET1和SRD5A2的mRNA表達水平的相對比值。

轉染48h后，抽提總蛋白，行蛋白定量、電泳、轉膜、封閉。4℃條件下TET1和SRD5A2抗體(1∶1000)孵育過夜，熒光二抗(1∶1000)孵育后，用Odyseey數字顯像系統采集信號(以GADPH為內參)。應用QuantityOne軟件進行分析，以目的蛋白條帶的灰度值與內參照GADPH蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達水平(實驗重復3次)。

1.10 CCK-8法檢測轉染后對細胞增殖的影響

收集6孔板中轉染Ctrl組、TET1-OE組、TET1-KD組0、24、48、72h后的Rwpe-1細胞檢測，細胞增殖活性，每孔加入20μL CCK-8，孵育4h，用酶標儀檢測波長450nm處光密度(D450)，各組求均值，描繪總的生長曲線。每組設6個復孔(實驗重復3次)。

1.11 流式細胞術檢測各組細胞凋亡率

用Annexin V-FITC和PI標記流式細胞技術對轉染后的Rwpe-1細胞系進行檢測。消化并收集轉染48h后的Rwpe-1細胞，將試劑盒中10× Annexin V結合液以蒸餾水稀釋10倍。用1× Annexin V結合液懸浮細胞，使其密度為1×106/mL。取100μL上述步驟的細胞懸液，加入新的管中。向細胞懸液中加入5μL Annexin V-FITC結合物，再加5μL碘化丙啶溶液。避光條件下常溫繼續培養細胞15min，加入400μL 1×Annexin V結合液,Tube管置于流式細胞儀中，盡快檢測(最好在1h內)以免細胞活性下降。實驗重復3次，結果取平均值。

1.12 統計學處理

應用SPSS 21.00軟件對數據進行統計學分析。免疫組化結果分析采用卡方檢驗。兩組間的比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 免疫組化檢測組織中TET1、5-mc和SRD5A2表達差異

在BPH移行帶及外周帶組織中，TET1表達于上皮及間質細胞，胞質陽性，移行帶中顯色強度高于外周帶，陽性細胞數目增多，陽性率明顯升高(P<0.05)；組織甲基化染色呈細胞核陽性，移行帶中顯色強度及陽性細胞數目低于外周帶，陽性率明顯降低(P<0.05)；Ⅱ型5α-還原酶表達于上皮及間質細胞，以上皮細胞表達占優，細胞核及胞質均可呈陽性，移行帶中顯色強度及陽性細胞數目高于外周帶，陽性率明顯升高(P<0.05)。

A組中TET1、5-mc、Ⅱ型5α-還原酶的表達量在外周帶和移行帶中無明顯差異(P>0.05)；B組和C組中TET1、Ⅱ型5α-還原酶在移行帶中的表達高于外周帶，移行帶中5-mc的表達低于外周帶，甲基化狀態降低，見圖1～3。

圖1 前列腺組織免疫組化染色結果Fig.1 The immunohistochemical staining of the prostate tissue

圖2 前列腺組織免疫組化TET1陽性率Fig.2 TET1 positive rate of immunohistochemistry of the prostate tissuePZ： 外周帶，TZ： 移行帶；與外周帶相比，**P<0.01

圖3 前列腺組織免疫組化甲基化狀態、Ⅱ型5α-還原酶陽性率Fig.3 Methylation status and 5 α-reductase Ⅱ positive rate of immunohistochemical methylation in prostate tissue與外周帶相比，*P<0.05，**P<0.01

2.2 各組前列腺組織TET1和SRD5A2基因表達

qRT-PCR顯示A組中外周帶和移行帶相比TET1和SRD5A2的mRNA表達量差異無統計學意義(P>0.05)；而在B和C組中，移行帶中TET1和SRD5A2的mRNA表達量高于外周帶，見圖4。

圖4 三組樣本中TET1和SRD5A2 mRNA表達Fig.4 Expression of TET1 and SRD5A2 mRNA in three groups of sample與外周帶和移行帶相比，*P<0.05

2.3 各組前列腺組織中DHT水平

A組外周帶和移行帶中DHT含量差異無統計學意義(P>0.05)，B組和C組移行帶中DHT含量高于外周帶，差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖5。

圖5 三組樣本外周帶和移行帶中DHT含量Fig.5 Expression of DHT in three groups of sample與外周帶相比，*P<0.05

2.4 各組細胞增殖速度比較

TET1-OE組細胞增殖速度大于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)。與對照組相比，TET1-KD組細胞增殖速度慢(P<0.05)，差異具有統計學意義，見圖6。

圖6 Rwpe-1細胞增殖實驗Fig.6 The proliferation assay of Rwpe-1 cell

2.5 各組細胞Ⅱ型5α-還原酶蛋白表達

與對照組TET1-Ctrl(0.98±0.22)比較，TET1-OE組(1.52±0.34)Ⅱ型5α-還原酶蛋白表達量增加(P<0.05)，TET1-KD組(0.52±0.18)表達量下降，差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖7。

圖7 Western印跡法檢測各組TET1和SRD5A2蛋白表達結果Fig.7 The protein expression of TET1 and SRD5A2 in each group with Western blotting

2.6 qPCR檢測各組細胞mRNA水平變化

與對照組(0.99±0.18)相比，TET1-OE組(40.12±4.62)細胞SRD5A2基因mRNA水平量上升(P<0.05)，TET1-KD組(0.64±0.22)細胞SRD5A2基因mRNA水平量下降，差異具有統計學意義(P<0.05)。

2.7 敲減或過表達TET1對Rwpe-1細胞凋亡的影響

流式細胞術結果(圖8)顯示，TET1-OE組(3.61%±0.26)細胞凋亡率較陰性對照組TET1-Ctrl(7.00%±0.23)降低，TET1-KD組(11.10%±0.48)增加(P<0.05)。

圖8 流式細胞術檢測各組細胞48h凋亡圖Fig.8 The cell apoptosis in each group under flow cytometry

3 討 論

BPH是常見的引起中老年男性排尿障礙的原因，主要表現為下尿路梗阻癥狀，隨著年齡增長發病率增高[8]。目前臨床上主要采用觀察等待、藥物治療和手術治療三級策略[9],這其中要與前列腺癌治療相區別[10]。藥物治療主要有5α-還原酶抑制劑等，但仍有20%～30%的患者無效，手術治療也因其手術適應證和并發癥而只適用于部分群體[11-13]。研究報道先天性缺乏Ⅱ型5α還原酶的人群及青春期前去勢的人群均不會發生BPH，BPH組織中Ⅱ型5α還原酶表達高于正常前列腺組織，且表達強度與BPH體積呈正比關系。Ⅱ型5α還原酶基因SRD5A2啟動子區域的DNA甲基化狀態可影響Ⅱ型5α還原酶蛋白的表達，DNA甲基轉移酶1(DNMT1)通過甲基化SRD5A2啟動子使Ⅱ型5α還原酶表達明顯下降；SRD5A2基因位于2p23的染色體上，DNA甲基化修飾受到DNA羥甲基化酶TET1的調控，TET1可發揮羥化酶活性去除5-甲基胞嘧啶的甲基化修飾，使得DNA甲基化的作用被移除[4-6]。DNA甲基化是DNA分子中的胞嘧啶處于甲基化狀態，CpG島可抑制所在基因的表達，與疾病的發生和發展有著密切關系，甲基化修飾不像轉錄因子調控那樣快速，其只是基因表達調控過程中的一種中間形式,也無永久性的遺傳改變的特點,甲基化僅影響核酸鏈中的胞嘧啶，其中約有50%的基因在啟動子區域有集中分布的島的存在，長度0.5～2kb[14]。因此推測在前列腺增生過程中，可能是移行帶中TET1選擇性過表達發揮去甲基化作用降低Ⅱ型5α-還原酶基因SRD5A2啟動子區域的甲基化水平，Ⅱ型5α-還原酶表達增多促進睪酮轉化為DHT的水平增加，打破前列腺細胞的增殖凋亡平衡，使細胞過度增殖而導致增生。

本研究分別通過臨床病例和細胞水平來驗證和探究該機制。臨床病例結果顯示，前列腺增生病例移行帶中TET1和Ⅱ型5α還原酶的表達量高于外周帶，甲基化水平低于外周帶，DHT的水平高于外周帶。利用慢病毒轉染系統分別過表達和敲減人前列腺上皮細胞Rwpe-1的TET1基因，檢測細胞的增殖凋亡水平，發現過表達組細胞的增殖能力高于敲減組，凋亡水平低于敲減組，且Ⅱ型5α還原酶SRD5A2的表達水平明顯高于敲減組。結果提示TET1很可能是通過發揮去甲基化作用降低SRD5A2啟動子的甲基化水平促進Ⅱ型5α還原酶表達，促進細胞增殖導致過度增生。更進一步的研究有待于運用染色質免疫共沉淀技術，利用特定的抗體結合染色體并使其片段沉淀，隨后通過實時PCR方法檢測目標片段中DNA的富集比例來檢測SRD5A2啟動子區域CPG島的甲基化狀態水平。TET1在前列腺移行帶增生中的特異性作用的機制研究將有助于為治療前列腺增生提供新的理論依據和靶標。