紅曲菌深層發酵工藝技術

廣東天益生物科技有限公司 廣東湛江 524300

紅曲是指以大米為原料，用紅曲菌屬紅曲霉菌發酵培養制得，是具有中國特色的傳統發酵產品。紅曲可分為色曲(作為食品添加劑)、酒曲(作為釀酒糖化發酵用)和功能性紅曲(作為保健品和藥品原料)。紅曲自古以來就具有食用和藥用價值，藥用價值在《本草綱目》中早有記載：紅曲甘溫無毒，主治：消食活血、健脾燥胃、治赤白痢下水谷，釀酒破血行藥勢及產后惡血不盡等。色曲則用作食品添加劑的紅曲色素，在食品中起著色增香作用，已廣泛用于肉制品、調味品、糕點、糖果、飲料等行業，尤其在肉制品中應用最廣。因紅曲色素與蛋白質類結合非常牢固，耐光耐熱性好，不易褪色，應用于肉制品加工，可起到發色、防腐等作用，可以減少肉制品中亞硝酸鹽的用量，且食用時口感更佳，提高了產品的品質和安全性。功能性紅曲是指紅曲菌在發酵過程中可合成具有生物活性的代謝產物，如莫納可林K、麥角甾醇、輔酶Q10等的一類紅曲，具有非常好的保健、藥用價值。

作為我國藥食兩用，具有上千年生產應用歷史的傳統產品紅曲，其生產方式主要采用傳統的固態發酵法，工藝相對簡單、成熟，如地面制曲、曲盤制曲，但生產條件相對粗放，發酵周期長，雜菌污染率高，存在食品安全隱患，加之勞動強度大，產能嚴重受限。其后發展為通風制曲，生產環境得以改善、發酵水平、產品質量、產能等都有大幅提高，但仍屬開放式培養，污染雜菌和桔霉素超標問題，嚴重制約了行業的發展。

功能性紅曲的生產，因發酵周期長，工藝技術要求高，從最初的淺盤制曲，到現在規模化的三角瓶生產制曲，桔青霉素等有害成分的代謝得到了較好的控制，但存在勞動強度大，產品質量波動及產能受限等。而采用大容量的固態發酵裝置(發酵罐)，技術欠成熟，投入產出比低，目前在中國尚未能規模化生產。

隨著生物工程技術的不斷進步，紅曲液態發酵工藝和技術在20世紀80年代取得進展，深層發酵紅曲色素在90年代初就實現了規模化生產。隨著技術的進步，研究的深入，通過對菌種持續的篩選、生產工藝不斷的優化，紅曲菌在流動的米粉基質內，輔以充足的無菌空氣，純種紅曲菌生長代謝旺盛，能大幅度縮短生產周期，發酵水平得到大幅提高，目前60m3發酵罐的發酵周期3d左右，發酵色價高達920U/mL，有望突破1 000U/mL，年平均發酵水平可達800U/mL。

由于液態發酵生產工藝和配方可控性強，易于實現自動化、規模化生產，提高產能，不僅生產成本能有效控制；而且能有效控制紅曲代謝過程中桔青霉素的產生，(桔青霉素含量<0.04mg/kg，以單位色價計)，產品雜質少、色調純正、質量穩定，在天然色素產品中性價比非常高，深受食品加工行業的青睞，對食用著色劑行業產生了劃時代的影響。

紅曲米作為傳統的著色劑，主要賦予食品著色的功能，在我國食品加工業中仍然有較大的市場，目前，紅曲米國家標準尚未將桔青霉素含量指標納入國家標準。由于固態發酵工藝生產的紅曲米，普遍存在桔青霉素含量超標問題，嚴重制約了紅曲米的廣泛應用，已成為我國紅曲米出口的瓶頸，我國紅曲米已基本退出歐美等市場。

1 液態發酵紅曲米的生產

為了解決固態發酵工藝紅曲米桔霉素超標問題，廣東天益集二十多年對紅曲液態發酵的研究和生產經驗，通過工藝配方的改進，探索利用液態發酵工藝生產紅曲米。

斜面菌種→種子液培養(6～10d)

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工藝流程：大米→磨漿→配料→滅菌→發酵罐培養(70～80h)→均質→噴霧干燥→篩粉→包裝→成品。

以大米為原料，制作成液體培養基，采用機械攪拌發酵罐作為容器，進行紅曲菌純種發酵，通入無菌空氣，減少雜菌污染的機率，讓菌體迅速生產和合成代謝產物紅曲色素。通過對發酵工藝條件多方面的調控，控制次級代謝產物桔青霉素的產生。隨著發酵時間的增加，菌體產生的代謝物質色素含量也逐步增多，產品色價也是逐漸提高(如圖1)。因此，可以根據終產品的色價確定發酵周期，終產品色價要求高發酵周期相對延長(80h以上)，色價要求低發酵周期就短，發酵周期可靈活掌控，但從生產成本和效率的角度考慮，發酵到終點是最佳的。

表1 固態、液態發酵紅曲米產品質量對比情況(公司數據)

對固態發酵與液態發酵紅曲米產品進行代謝產物的分析檢測(表1、表2)，表明液態發酵紅曲米的色價可達到>9 000u/g，同時對應的桔青霉素含量能達到紅曲色素國標要求≤0.04mg/kg(以單位色價計)；與固態發酵紅曲米產品色價相同的條件下比較，液態紅曲米的桔青霉素和黃曲霉毒素B1等指標均可以得到有效控制。

從我們內部檢驗數據分析，桔青霉素含量在發酵過程中可以控制在非常低的范圍而且很穩定，可以徹底解決產品的安全性問題。

表2 固態、液態發酵紅曲米產品質量對比情況(第三方機構檢驗數據)

通過固、液態發酵工藝對比：固態發酵紅曲米產品含有大量淀粉，其次是色素；液態發酵生產紅曲色素、紅曲米，主要代謝產物是色素，而菌絲體中含有非常豐富的營養物質，具有良好的利用價值。李燚等[1]對紅曲色素生產中的菌絲體進行成分分析，發現紅曲霉液態發酵菌絲體的色價較高，營養豐富，高蛋白，低脂肪，富含不飽和脂肪酸及多種微量元素，有毒金屬含量很低，安全無毒；還含有莫拉可林K、γ-氨基丁酸、麥角固醇等多種功能性成分，具有一定的降血脂、降血壓功效。吳鐵等[2]采用紅曲液態發酵工藝提取色素后剩下的紅曲菌絲體的提取物，經動物實驗發現具有降血脂和預防骨質疏松的作用，可以作為功能性食品或保健食品配料，具有極高的應用開發價值。因此從生產工藝控制、產品質量、營養價值等多方面比較，液態發酵紅曲色素、紅曲米工藝的優勢都是非常明顯的(見表3)。

表3 固態、液態發酵紅曲米生產方式的對比情況

2 液態發酵功能性紅曲的生產

2.1 固態發酵工藝

固態發酵功能紅曲，是將紅曲菌接種在蒸熟的米粒上，在一定的溫度、濕度、通風等條件下，紅曲菌在米粒培養基上生長、繁殖、代謝，其標志性產物為Monacolin K。目前以三角瓶生產方式為主，投入少、技術相對成熟，標志性產物Monacolin K的發酵水平可以達到3.5%以上，桔青霉素含量基本能控制在標準范圍內。

斜面菌種→種子液

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大米→蒸飯(滅菌)→冷卻→接種→發酵培養(30～35d)→干燥→粉碎→篩粉→包裝。

具體操作步驟如下。

(1)斜面培養。將試管菌種接種于斜面培養基，置30～35℃恒溫箱培養6～10d。

(2)種子液培養。采用三角瓶擴大培養，接種量5%，30～35℃恒溫培養30～48h。

(3)配料。以大米為原料，配制成固體培養基，經過滅菌后冷卻待用。

(4)接種、培養。接種量10%～15%，24～28℃培養25～35d。

(5)干燥、粉碎、篩粉、包裝。達到發酵終點，放瓶干燥，再經過粉碎、篩粉后包裝粉末狀成品。

固態發酵具有投資低、能耗低等優點，但菌體生產速度比較緩慢，發酵周期長，質量易波動，占地面積大，自動化程度不高，勞動強度大，生產成本比較高，產能增加的局限性很大，工藝技術水平難以提升，不利于紅曲推廣應用，產業發展受限。

2.2 液態發酵工藝

液態發酵功能紅曲。以大米或其他淀粉質原料，制成液體培養基，采用機械攪拌大容量的發酵罐,在罐內通入無菌空氣進行紅曲菌純種發酵，根據菌體發酵各時段對培養條件的需求，對工藝參數進行靈活控制。

斜面菌種(6～10d)種子液培養

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采用液態發酵工藝，基質的混合和擴散非常均勻，有效的提高溶氧和其它營養成分的傳遞擴散速度，利于抑制桔青霉素的生成，促進目標代謝產物的合成。這種方式的優勢非常明顯：有效利用現代生物工程技術，自動化程度高，產品污染率低，工藝可控性強，可有效縮短發酵周期，批次產品質量均一，產能容易提高，具有巨大的發展潛力。紅曲菌深層發酵紅曲色素的產業化是20世紀90年代初紅曲行業的重大突破，也是紅曲行業技術進步的標志之一。

功能紅曲液態發酵技術至今還未形成規模化生產，在工藝技術方面尚需深入研究，可從菌種的選育、培養基的原料種類、碳氮比、溫度、溶氧值工藝技術等關鍵控制參數方面著手，達到提高代謝產物濃度，縮短發酵周期，形成規模化生產之目的。

(1)菌種的選育。通過對菌種的誘變，篩選出適合深層發酵工藝的菌株，并且達到高產Monacolin K等功能活性物質，低產或不產桔青霉素等有害物質的目的。

(2)原料種類。傳統功能紅曲的發酵一般采用大米為原料，一些實驗研究報道表明，紅曲菌在多種谷物或淀粉質原料上均生長良好，目標代謝產物Monacolin K的含量高，桔青霉素含量也能控制得當。陳勉華[3]等采用大米、玉米、高豌豆、糜子、黑米、麥麩等10余種谷物培養基進行實驗，并且通過多種谷物復配使用，可以提高Monacolin K和GABA的含量，還能成功抑制桔青霉素的生成。淀粉質原料如葡萄糖、甘油、其他糖醇類等添加玉米漿、酵母抽提物也能有效促進紅曲菌的生長和提高代謝產物的合成，達到同樣的效果。由于各種谷物對人體都有不同的益處，而這些谷物都非常易得，利用紅曲菌可以將不同種類谷物和淀粉質原料制備成多樣化的具有降脂功能的紅曲食品，豐富人們的飲食生活，又能達到保健目的。

(3)碳氮比。深層發酵培養基中的碳源主要是谷物或淀粉類物質，如大米、燕麥、葡萄糖、甘油等，氮源為玉米漿、黃豆粉、蛋白胨、酵母抽提物等物質，高濃度發酵從理論上是能提高發酵效率，但高濃度也會使菌體生長受抑制，代謝產物合成減少；低濃度發酵中后期營養耗盡后勁不足，無法正常分泌代謝產物，發酵水平也不理想。因此，適當的碳氮比例對發酵過程中菌體生長和溶氧效果、產物的代謝都有著直接的影響，另外發酵過程中可據菌體的生長情況和培養基的殘糖，采用補料的方式，適當給菌種增加營養物質，提高菌體的代謝能力。

(4)溫度。溫度是發酵控制的關鍵參數，是菌體生長、分泌代謝產物和有害物質非常關鍵的環境因素。紅曲菌發酵初期是菌體生長快速期，前期適當提高溫度使菌體迅速生長、繁殖快，縮短發酵周期；發酵中期、后期是合成、分泌代謝產物的關鍵期，可以促進Monacolin K的合成和代謝，控制低溫可以有效抑制桔霉素的合成。

(5)溶氧。深層發酵工藝溶氧效果主要與機械攪拌、通風比、培養基的濃度比等因素有關。在這些影響因素中，攪拌轉速是影響紅曲菌液態發酵罐發酵的菌體和Monacolin K產量的最重要的因素。發酵過程中菌體對溶氧在不同時期有不同要求，應根據具體發酵罐體積、濃度比等條件而定，合理調整攪拌轉速，使得菌體能正常生長，促使菌體高效合成目標產物，提高發酵水平。

2.3 代謝產物

自上世紀80年代以來，功能性紅曲中的Monacolin類化合物被陸續發現并證實具有顯著抑制體內膽固醇合成的活性，Monacolin類化合物中Monacolin K是最主要的他汀類物質，是一類高效的降脂藥物，能有效地抑制膽固醇合成限速酶HMG-CoA還原酶的活性，降低人體內源性膽固醇合成，減少細胞內膽固醇貯存，降低血液中低密度脂蛋白膽固醇(LDLC)的濃度[3]，提高血液中高密度脂蛋白膽固醇的濃度，從而有效地預防動脈粥樣硬化，甚至能逆轉動脈粥樣硬化。紅曲菌在代謝過程除了可以產生Monacolin類化合物，還有其他活性功能成分陸續被發現，如γ-氨基丁酸(降血壓)、麥角甾醇(預防骨質疏松)、輔酶Q10(抗衰老)、支鏈氨基酸等(減肥)，Dimerumic酸(護肝)、黃酮酚(抗氧化)，紅曲多糖(調節免疫力)、紅曲黃色素(抗癌)等。

降脂紅曲中Monacolin K有酸式和內酯型兩種構型，人體中真正發揮作用的是酸式Monacolin K，它可以直接被人體吸收，不需要人體內的羥基酯酶參與水解，不增加肝、腎負擔，直接發揮降脂作用[4]。固態發酵功能性紅曲產品中莫納可林K(MK)是同時含有開環結構和閉環結構的，在發酵10d及以前都是開環，在其后的發酵過程中開環結構比例會大幅度減少，后處理的烘干工藝會造成這兩種比例的變化。產品烘干過程中，溫度越高，烘干時間越長，則開環結構轉化為閉環結構的就越多，一般最終成品中閉環結構達80%以上。市場銷售的降脂紅曲產品中，閉環結構占比達80%以上，閉環結構無活性，需經人體產生的羥基酯酶水解，改變結構后才能產生活性，發揮降脂功能。固態發酵功能紅曲產品除了含有降脂功效的Monacolin K之外，還含有大量的殘余淀粉，由于其水溶性差，無法直接添加到液態食品中使用，因此常用紅曲粉膠囊作為保健品或藥品的終端產品形式，這很大程度上限制了功能性紅曲的使用范圍。

近幾年，廣東天益生物科技有限公司也一直在從事液態發酵功能紅曲生產工藝的研究和探索，并獲得一定的實驗成果，完成了搖瓶小試實驗和1.5m3發酵罐的中試實驗，平均發酵水平Monacolin K含量能達到700mg/L，最高可達到960mg/L。經檢測分析見表4，表5，紅曲菌液態發酵代謝產物中可以檢測到多種有效活性成分，如Monacolin K、麥角甾醇、γ-氨基丁酸、紅曲多糖等物質，同時還發現發酵液中的主要功能成分Monacolin K，酸式占比非常大，內酯式Monacolin K很少。液態發酵菌絲體可以同時分泌胞外和胞內代謝產物Monacolin K，由于菌絲體濃度較低，胞內產物的占比也較少，分泌到胞外的Monacolin K占總量的75%以上，而且都是胞外產物水溶性Monacolin K。這些胞外水溶性Monacolin K更有利于人體的吸收利用，將發酵液分離菌絲體后，菌絲體可以加工成粉狀功能紅曲產品，濾液可以直接開發成液態食品，將功能紅曲開發成普通食品如乳制品、飲料、調味品、酒等，開拓液態功能紅曲食品的新領域，讓更多人受益。

表4 內部實驗室檢驗數據(液相色譜法)

表5 第三方機構檢驗數據

功能紅曲有效活性成分陸續在研究過程中被發現，但由于目前國內外對有效活性成分的檢驗方法的研究比較少，也沒有制定統一、標準的檢驗方法，對有效活性成分的定量分析檢驗結果存在較大的差異，并且由于方法不一致，可能無法檢測到某些成分，不利于功能紅曲產品的開發。

3 展望

當前，紅曲米、功能紅曲等產品大都采用固態發酵生產方式，紅曲色素產品(>95%)是采用液態發酵生產方式。固態發酵或液態發酵的生產方式，各具優勢和特點，固態發酵投資少、設備簡單，生產條件相對粗放，發酵周期長，雜菌污染率高，存在食品安全隱患，工人勞動強度大，自動化程度不高，產能提升受限明顯，行業發展較為緩慢；液態發酵投資大、設備相對復雜，自動化程度高，工藝可控性強，能促進目標代謝產物之合成，發酵周期短，產品污染率低，能有效抑制桔青霉素的生成，確保紅曲產品的安全性和質量穩定，產能提升快，能滿足健康食品行業的規模化需求，具有巨大的發展潛力，從而促進行業能迅速發展。結合國家倡導，國民期盼的大健康產業的發展，從食品安全、技術進步和行業的健康發展等綜合因素考量，紅曲液態發酵工藝都具有明顯的發展優勢。

目前，制約我國紅曲產業發展主要問題。

一是紅曲產品應用定位問題，紅曲米與紅曲色素均被以食品添加劑(著色劑)收錄在GB2760中，主要賦予食品著色的功能，并嚴格限制其使用范圍及使用量，而紅曲具有功能性食品的屬性未能得到開發應用，嚴重制約了紅曲產品的應用和行業的發展。

二是產品標準與行業技術創新和發展不匹配，功能性紅曲產品目前只有輕工行業標準(QB/T2847-2007)，沒有制定相應的國家標準，產品的生產和銷售在法規上難于合法化；紅曲米國家標準(GB1886.19-2015)雖未明確生產工藝方式，但職能監管部門仍然認可的是固態發酵工藝，使液態發酵紅曲米生產工藝受到質疑，由于傳統的固態發酵工藝很難有效控制桔青霉素的產生，而紅曲米國家標準至今沒有列入桔青霉素指標，目前桔青霉素超標問題成為紅曲米拓展國外市場的瓶頸。標準中對紅曲發酵工藝方式的限定，嚴重制約了行業的技術創新和發展，成為紅曲產業技術創新與健康發展的瓶頸。

紅曲在我國已有上千年生產應用歷史，是中華民族的智慧結晶，是祖先留下的瑰寶，是具有藥、食兩用的傳統產品。隨著現代科技的發展和生物技術的進步，對紅曲研究的深入，紅曲代謝產物及許多新的功效作用不斷被發現，隨著經濟的發展，生活水平的提高，人們對健康意識的增強，對食品的要求不再僅限于色、香、味、俱全，對食品的營養和功能有了新的追求，紅曲正是具有“天然、營養、功能性”的特點，成為眾人關注的焦點，因此，紅曲更應該作為食品配料開發，充分挖掘紅曲功能性食品的屬性，而不僅僅是作為食品添加劑應用，圍繞大健康產業，大力開發紅曲健康食品；其次，應將傳統產品與現代技術緊密結合，在傳承的基礎上應用現代生物技術挖掘紅曲精髓，充分發揮液態發酵工藝優勢，以新工藝、新技術的應用，推動行業技術創新與產業升級，讓千年紅曲煥發生機，讓紅曲為人類的健康發揮更大的作用。