2型糖尿病合并急性胰腺炎大鼠腸道菌群變化及其與胰腺炎病情進展的關(guān)系

張榮芳，吳敏娜，張靜，倪軍，王永磊，霍劍鋒

(1中國人民解放軍第三七一醫(yī)院，河南新鄉(xiāng) 453000；2新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

2型糖尿病(T2DM)患者長期處于高血糖狀態(tài)，其機體免疫功能低下，內(nèi)環(huán)境紊亂，容易引發(fā)腸源性感染，而糖尿病并發(fā)急性胰腺炎(AP)就是其中之一[1,2]。美國有一項回顧性研究指出，糖尿患者患AP的幾率是普通人群的1.86～2.89倍[3]，病死率也遠高于普通人，糖尿病合并AP患者的發(fā)病率為54/10萬人年[4]，究其原因主要是腸道黏膜屏障破壞和腸道通透性增加[5]。目前，相關(guān)研究以T2DM合并AP患者病例特點分析為主，而腸道菌群結(jié)構(gòu)變化方面研究甚少。本研究檢測了T2DM合并AP大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)變化，并分析其與AP病情進展的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 T2DM大鼠38只，Wistar健康大鼠33只，體質(zhì)量180 g左右，8～10周齡。飼養(yǎng)在室溫25 ℃左右的動物房內(nèi)，內(nèi)置專用鼠籠，相對濕度40%～70%，實驗動物飼養(yǎng)和處理都按照動物福利和倫理原則執(zhí)行。

1.2 主要試劑及儀器 牛磺膽酸鈉(Sigma公司)，TIANamp Stool DNA Kit(北京天根生化科技有限公司)，大腸埃希菌和雙歧桿菌引物(上海生物工程科技有限公司)，瓊脂糖(Sigma公司)，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(DP209，上海生物工程科技有限公司)，溴乙錠(北京鼎國昌盛生物科技有限責(zé)任公司)，DM3000DNA Marker (上海生物工程科技有限公司)，質(zhì)粒提取試劑盒(上海生物工程科技有限公司)，a-淀粉酶測定試劑盒(EPS法，廣州兆康生物科技有限公司)，脂肪酶測定試劑盒(速率法，廣州兆康生物科技有限公司)，血糖測定試劑盒(葡萄糖氧化酶法，廣州兆康生物科技有限公司)；Nano Drop2000紫外分光光度計(美國Termo公司)，-80 ℃低溫冰箱(美國Termo公司)，熒光定量Light Cycler PCR儀(美國Bio-Rad公司)，EC3凝膠成像系統(tǒng)(美國UVP公司)，常溫離心機Labofuge400(美國Thermo公司)，瓊脂糖電泳儀DYCP-31DN(北京六一)，紫外分析儀(上海驥輝科學(xué)分析儀器有限公司)，電子天平(上海麗馳計量儀器有限公司)，酶標儀(美國熱電)，全自動生化分析儀(美國雅培)。

1.3 實驗動物分組及T2DM合并AP模型制備 大鼠于術(shù)前12 h禁食，自由飲水。38只T2DM大鼠隨機挑選20只，腹腔注射戊巴比妥溶液(2 mg/100 g體質(zhì)量)麻醉，用3.5%牛黃膽酸鈉(1 mL/kg體質(zhì)量)以0.2 mL/min的速度沿胰膽管逆行注射構(gòu)建T2DM合并AP模型(A組)；余下18只作為糖尿病組(C組)，以同樣的劑量和同等的速度注射生理鹽水。33只Wistar大鼠隨機挑選15只腹腔注射戊巴比妥溶液(2 mg/100 g體質(zhì)量)麻醉，用3.5%牛黃膽酸鈉(1 mL/kg體質(zhì)量)以0.2 mL/min的速度沿胰膽管逆行注射構(gòu)建單純AP模型(B組)[6]；剩余的18只作為正常對照組(D組)，以同樣的劑量和同等的速度注射生理鹽水。動物模型制備成功標準：注射3.5%的牛黃膽酸鈉24 h內(nèi)，B組和A組大鼠出現(xiàn)明顯的AP癥狀，即大鼠呈現(xiàn)焦慮、煩躁，并伴有嘔吐現(xiàn)象；大鼠胰腺組織切片顯示組織水腫、出血，組織結(jié)構(gòu)邊界不明顯，組織浸潤現(xiàn)象嚴重。動物模型納入標準：①采用全自動生化分析儀檢測血清胰淀粉酶和脂肪酶活性較給藥前升高3倍以上；②光鏡下采用改良的schmidt法對胰腺組織進行病理學(xué)評分達標。動物模型剔除標準：①給藥過程中死亡，或給藥后迅速死亡；②胰淀粉酶測試低于3倍；③病理切片評分未達標。

1.4 大鼠糞便總細菌、大腸埃希菌、雙歧桿菌豐度檢測 分別收集各組大鼠給3.5%牛黃膽酸鈉或生理鹽水前(0 h)及24、48 h的糞便樣品1～2 g，提取糞便細菌基因組總DNA，利用16S rRNA V3區(qū)通用引物(341F/518R)和功能菌群特異性引物(大腸埃希菌和雙歧桿菌)，通過實時熒光定量PCR檢測總細菌、大腸埃希菌、雙歧桿菌的豐度，最終結(jié)果以細菌拷貝數(shù)的常用對數(shù)/g糞便表示。

1.5 大鼠血清淀粉酶、脂肪酶檢測 分別采集各組大鼠給3.5%牛黃膽酸鈉或生理鹽水前(0 h)及24、48 h的靜脈血2 mL，1 000 g離心10 min，后取血清，分裝于無菌EP管內(nèi)，采用全自動生化分析儀檢測血清淀粉酶和脂肪酶。

1.6 胰腺組織病理學(xué)評估 于給3.5%牛黃膽酸鈉或生理鹽水前(0 h)及24、48 h，采用斷頭法處死大鼠，取胰頭組織，用100 mL/L甲醛溶液固定，常規(guī)脫水，包埋，切片，HE染色，由兩位病理學(xué)醫(yī)師分別對胰腺組織進行雙盲評分。胰腺損傷分別以Schmidt[7]標準進行評分。

2 結(jié)果

2.1 各組糞便總細菌、大腸埃希菌、雙歧桿菌豐度比較 結(jié)果見表1。

表1 各組糞便總細菌、大腸埃希菌、雙歧桿菌豐度比較(細菌拷貝數(shù)的常用對數(shù)/g糞便，

注：與C組比較，△P<0.05；與D組比較，*P<0.05；與同組0 h比較，▲P<0.05；與同組24 h比較，#P<0.05。

2.2 各組血清淀粉酶、脂肪酶比較 結(jié)果見表2。

表2 各組血清淀粉酶、脂肪酶比較

注：與C組比較，△P<0.05；與D組比較，*P<0.05；與同組0 h比較，▲P<0.05；與同組24 h比較，#P<0.05。

2.3 各組胰腺組織病理學(xué)評分比較 結(jié)果見表3。

表3 各組胰腺組織病理學(xué)評分比較(分，

注：與C組比較，△P<0.05；與D組比較，*P<0.05；與同組0 h比較，▲P<0.05；與同組24 h比較，#P<0.05。

2.4 A組和B組大腸埃希菌、雙歧桿菌豐度變化與病理評分的相關(guān)性 A組和B組大腸埃希菌變化趨勢與病理學(xué)評分呈正相關(guān)(r=0.738，P<0.05)，雙歧桿菌的變化趨勢與病理學(xué)評分呈負相關(guān)(r=-0.875，P<0.05)，詳見圖1。

3 討論

T2DM屬于慢性代謝性疾病[8]，合理有效的控制血糖，病死率可以降低到接近為零[9]。但是由于糖尿病患者抵抗力較健康人有明顯的下降，極易產(chǎn)生各種并發(fā)癥。美國糖尿病協(xié)會的一項回顧性研究分析指出，T2DM患者得AP的風(fēng)險是普通人群的1.86～2.89倍[10]。大量T2DM合并急性應(yīng)急損傷的患者給臨床治療帶來很多困擾[11]，也增加了糖尿病患者的臨床死亡風(fēng)險和經(jīng)濟負擔[12]。為方便對其中機制展開更為深入的研究，合理的動物模型的建立便具有很大的必要性。我們通過注射3.5%牛黃膽酸鈉促進Wistar大鼠發(fā)生AP，以此構(gòu)建普通大鼠AP模型[13]，同時在T2DM大鼠已患糖尿病的基礎(chǔ)上誘導(dǎo)AP，構(gòu)建糖尿病合并AP模型。實驗結(jié)果表明，模型構(gòu)建方式是成功的，兩種大鼠均出現(xiàn)了AP的癥狀，且非常典型，病理切片中炎癥浸潤現(xiàn)象嚴重，血清淀粉酶和脂肪酶水平顯著上升。

圖1 大腸埃希菌、雙歧桿菌豐度變化與病理評分的相關(guān)性

大量研究表明，雙歧桿菌、乳酸桿菌等屬于腸道益生菌，可以預(yù)防和緩解腸道炎癥反應(yīng)、阻止病原微生物的侵入機體和過度繁殖，同時分泌短鏈脂肪酸等對機體健康產(chǎn)生有益影響的功能[14]；而大腸埃希菌數(shù)量增多可導(dǎo)致大量革蘭氏陰性菌的脂多糖(LPS)入血，而LPS與TLR4結(jié)合可促發(fā)機體低度慢性炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致胰島素抵抗和其它代謝障礙[15]。也有研究[16,17]報道，補充益生菌能明顯降低病患者的內(nèi)毒素血癥，可有效恢復(fù)腸道內(nèi)的細菌定植。因此大腸埃希菌豐度增多可能是糖尿病發(fā)生胰腺損傷更嚴重的直接原因之一。本研究顯示，與C組比較，A組24、48 h雙歧桿菌豐度降低，24、48 h大腸埃希菌豐度升高；與D組比較，B組24、48 h雙歧桿菌豐度降低，24、48 h大腸埃希菌豐度升高；與同組0 h比較，A組和B組24 h大腸埃希菌豐度升高，雙歧桿菌豐度降低；與同組24 h比較，A組和B組48 h大腸埃希菌豐度升高，雙歧桿菌豐度降低。這說明大腸埃希菌和雙歧桿菌細菌豐度的變化參與了糖尿病并發(fā)AP的發(fā)生發(fā)展。本研究還顯示，與C組比較，A組24、48 h血清淀粉酶和脂肪酶水平升高；與D組比較，B組24、48 h血清淀粉酶和脂肪酶水平升高；與同組0 h比較，A組和B組24 h血清淀粉酶和脂肪酶水平升高；與同組24 h比較，A組和B組48 h血清淀粉酶和脂肪酶水平升高。與C組比較，A組24、48 h病理學(xué)評分增加；與D組比較，B組24、48 h病理學(xué)評分增加；與同組0 h比較，A組和B組24 h病理學(xué)評分增加；與同組24 h比較，A組和B組48 h病理學(xué)評分增加。提示腸道菌群結(jié)構(gòu)的改變加重了大鼠的炎癥反應(yīng)，而炎癥反應(yīng)的存在又加劇了腸道菌群的失衡，因此產(chǎn)生了惡性循環(huán)。本文結(jié)果顯示，B組和A組的大腸埃希菌變化趨勢與病理學(xué)評分呈直線正相關(guān)，雙歧桿菌的變化趨勢和病理學(xué)評分呈直線負相關(guān)。提示早期AP腸道菌群的紊亂可能是糖尿病并發(fā)急性胰腺損傷的始動因素之一。

總之，T2DM合并AP大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，其中大腸埃希菌和雙歧桿菌的豐度與AP的嚴重程度相關(guān)。相信隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及人們對腸道微生態(tài)研究的深入[18,19]，我們終將完全掌握糖尿病并發(fā)AP腸道菌群的變化，為選擇AP的最佳治療方案提供有力的證據(jù)，從而降低糖尿病患者患胰腺炎的風(fēng)險，減少致病病死率，改善AP整體預(yù)后。