自擬和痹方對人類風濕關節炎成纖維樣滑膜細胞炎癥因子分泌的影響及其機制探討

姜萍，邢潔，紀淳望，劉英，馬洪美，姜月華

(1山東中醫藥大學第一臨床醫學院，濟南 250014；2山東中醫藥大學中醫學院；3南昌大學醫學部；4山東中醫藥大學附屬醫院；5滕州市中醫院)

類風濕關節炎(RA)是一種以關節滑膜炎癥為基本病理表現的系統性自身免疫病。近年大量研究顯示，RA成纖維樣滑膜細胞(FLS)的過度增殖及炎癥因子的產生是RA發生發展和轉移的關鍵。膽堿能抗炎通路(CAP)是一條鏈接于神經系統與免疫系統之間的抗炎通路[1]，國內已有研究證實通過CAP可抑制FLS炎癥因子的分泌，減輕RA的炎癥反應[2]。但國內、外尚無相應的治療RA干預藥物。我們前期研究證實，和痹方不僅能有效緩解RA患者的關節腫痛，改善實驗室指標、滑膜厚度等，而且能夠緩解神疲乏力、精神萎靡等與迷走神經相關的全身癥狀[3,4]。本研究觀察了和痹方對RA中FLS炎癥因子分泌的影響，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、藥物、試劑及儀器 Wistar大鼠60只，8周齡，雌雄各半，體質量(150±20)g，SPF級，均購自山東大學醫學院動物實驗中心[合格證號為SCXK(魯)20160007]，購進大鼠后供給充足的水和飼料，預飼養7 d。和痹方(當歸20 g、白芍30 g、白術15 g、蒼術15 g、川芎20 g、防風9 g、青風藤20 g、腫節風30 g、生甘草6 g)由山東中醫藥大學附屬醫院制劑室提供，每毫升含生藥1 g的溶液，經高溫消毒封瓶，4 ℃冰箱保存備用；甲氨蝶呤片(MTX，2.5 mg/片，上海醫藥集團有限公司信誼制藥總廠)。PNU-282987(P6499，購于美國Sigma公司)，高遷移率組蛋白1(HMGB1)ELISA法試劑盒(HM10235)、白介素(IL)-17 ELISA法試劑盒(HM10198)均購于Bio Swamp公司，α7煙堿型乙酰膽堿受體(α7nAChR)兔單克隆抗體(ab76315,Abcam公司)，核轉錄因子-κB亞基p65(NF-κB p65)兔多克隆抗體(10745-1-ap)、山羊抗兔二抗(SA00001-2)均購于Proteintech公司。全波長酶標儀(Thermo Fisher 1510)，洗板機(FCC Compliance 76883)，消毒箱(熱空氣sut6120)，酶標儀(BIO-RAD iMARK)，電泳儀(BIO-RAD Power pac)，顯影儀(SAGECREATION Minichemi 420-k4)，超聲儀(南京先歐 XO-1000D變幅桿Ф3)。

1.2 和痹方藥物血清制備 將60只大鼠分為模型組、激動劑組、MTX組、低劑量組、中劑量組、高劑量組各10只。激動劑組：PNU-282987采用IEq鹽酸溶解后再次應用生理鹽水稀釋，按0.38 mg/kg[5]進行腹腔注射，每天注射1次；MTX組：MTX灌胃，劑量為0.7 mg/kg[6]，每周1次；低劑量組：中藥灌胃，3 g/kg，1次/d；中劑量組：中藥灌胃，6 g/kg，1次/d；高劑量組：中藥灌胃，12 g/kg，1次/d；模型組：生理鹽水適量灌胃。灌胃持續14 d，末次灌胃3 h后下腔靜脈取血，靜置后離心，56 ℃滅活，抽濾除菌，分裝，-20 ℃保存備用。

1.3 滑膜組織獲取及FLS分離、培養、鑒定 滑膜組織取材于山東中醫藥大學附屬醫院、山東省千佛山醫院、滕州市中醫院行膝關節置換術的RA患者(患者男1例、女5例，年齡55～69歲、平均62歲，病程8～20 a，平均14.33 a)。取材前征得患者的知情同意，并簽署知情同意書。RA診斷符合美國風濕病協會(ACR)2010年修訂的診斷標準。本研究經滕州市中醫院倫理委員會批準(批準號：2018001)。根據文獻[7]，采用消化酶培養法進行FLS培養、傳代。將FSL加入放入蓋玻片的6孔板培養72 h，對細胞貼片進行HE染色和細胞免疫組化按試劑盒操作，鼠抗人波形蛋白(vinlentin)單抗、FⅧ因子單抗、CD68單抗(均為1∶1 00稀釋)三染進行鑒定，以非免疫鼠IgG作為陰性對照。HE染色：細胞長梭狀極向排列，分裂相少見。免疫組化：滑膜巨噬樣細胞的標記CD68(-)、新生血管內皮細胞的標記FⅧ因子(-)、成纖維樣細胞的表面標記vinlentin +，符合人關節FSL特點。

1.4 FLS分組及和痹方藥物血清干預 將FLS移至6孔板中培養，隨機分為模型組、激動劑組、MTX組、低劑量組、中劑量組、高劑量組。激動劑組每孔加入含10%PNU-282987藥物血清的DMEM培養液；MTX組每孔加入含10% MTX藥物血清的DMEM培養液；低劑量組每孔加入含10%低劑量和痹方藥物血清的DMEM培養液；中劑量組每孔加入含10%中劑量和痹方藥物血清的DMEM培養液；高劑量組每孔加入含10%高劑量和痹方藥物血清的DMEM培養液；模型組每孔加入10%DMEM血清的培養液。24 h后取細胞上清液及滑膜細胞。

1.5 FLS上清液中IL-17、HMGB1檢測 按照ELISA試劑盒說明書檢測細胞上清液中IL-17、HMGB1。先加入標準品和待測樣品，設置陰性對照，用封板膜封板后置入37 ℃溫育30 min，揭去封膜，棄去液體，甩干，加洗滌液重復洗板5次。加入酶標試劑，再次置37 ℃溫育30 min，洗板5次，加顯色液A、B各50 μL，37 ℃避光顯色15 min，加入終止液終止反應，于450 nm波長酶標儀檢測吸光度(OD值)。

1.6 滑膜細胞中α7nAChR、NF-kBp65蛋白檢測 采用Western blotting法。具體操作參照文獻[8]，結果以灰度值表示。

1.7 滑膜細胞中α7nAChR mRNA檢測 采用RT-PCR法。按常規方法取得提取滑膜組織中總mRNA，進行逆轉錄、反轉錄反應，合成引物：5′-CAAGGCGAGTTCCAGAGGAG-3′，5′-GGGAGAAGTACACGGTGAGC-3′，擴增條件：95 ℃變性30 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，45個循環。將模型組mRNA的表達處理為標準，作為“1”，其他數值為檢驗值。具體公式如下：各組檢驗值=2-(待測周期均值該組內參周期均值)-(模型組待測周期均值-模型組內參周期均值)。

2 結果

2.1 各組細胞上清液中IL-17、HMGB1的OD值比較 結果見表1。

表1 各組細胞上清液中IL-17、HMGB1的OD值比較

注：與模型組比較，*P<0.05；與激動劑組比較，#P<0.05；與MTX組比較，ΔP<0.05。

2.2 各組細胞中α7nAChR、NF-kBp65蛋白及α7nAChR mRNA比較 結果見表2。

表2 各組細胞中α7nAChR、NF-kBp65蛋白及α7nAChR mRNA比較

注：與模型組比較，*P<0.05；與激動劑組比較，#P<0.05；與MTX組比較，ΔP<0.05；與低劑量組比較，□P<0.05；與中劑量組比較，▲P<0.05。

3 討論

RA是—種以對稱性多關節炎為主要臨床表現的自身免疫性疾病，以關節滑膜慢性炎癥、關節的進行性破壞為特征。FLS是RA炎性滑膜組織中的主要細胞成分，可向關節軟骨表面遷移和侵襲，導致關節軟骨及骨的侵蝕，最終引起關節破壞，在RA的發生發展過程中發揮重要作用[9,10]。

和痹方是臨床治療RA的經驗方劑，方中當歸、白術、蒼術、白芍疏肝健脾、活血理氣，青風藤、腫節風、防風、川芎祛風除濕、行氣活血、調通經絡，甘草調和諸藥?，F代藥理研究發現，白芍的有效成分白芍總苷具有抗炎鎮痛、調節免疫的作用，能夠抑制滑膜細胞的過度增殖，降低IL-1、前列腺素E2等炎癥因子水平[11]；此外，白芍還具有保肝作用，減輕藥物的不良反應。青藤堿能夠抑制NF-κB活化，降低炎癥因子水平[12]，腫節風具有調整機體免疫、抗炎鎮痛的作用，可降低腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-1等炎癥因子水平。防風與川芎也具有增強免疫力、消炎鎮痛的作用。前期研究結果顯示，和痹方能夠有效緩解RA患者的臨床癥狀及實驗室指標，減輕RA大鼠(CIA)的關節紅腫疼痛，降低CIA血清中IL-6、HMGB1等炎癥因子水平，減輕CIA關節軟骨的破壞[3,4,13,14]。

有研究發現，RA患者血清和關節滑液中IL-17水平均升高，并與RA疾病的嚴重程度相關[15]。IL-17是T細胞源性促炎因子，在RA發病早期即可通過上調誘導型氧化亞氮合酶促進關節軟骨細胞釋放一氧化氮，誘導基質金屬蛋白酶-1,3,13、環氧化酶-2、IL-6、基質降解酶以及IL-1的表達，參與骨侵蝕，促進慢性炎癥的發生[16]。同時，IL-17可以和TNF-α、γ-干擾素、IL-1β等細胞因子相互作用，產生協同效應。HMGB1可促使NF-κB及絲裂原活化蛋白激酶的激活，刺激單核細胞產生TNF-α、IL-1、IL-6及巨噬細胞炎癥蛋白，并激活吞噬細胞，誘導多種黏附分子的表達，是一種作用廣泛的促炎因子。已有研究證實，HMGB1的表達與ESR、CRP、關節壓痛數、關節腫脹數呈正相關，可作為評價RA病情活動的指標之一[17]。本實驗顯示，中劑量組、MTX組均可顯著降低IL-17、HMGB1水平，且中劑量組IL-17降低水平不及MTX組，兩組之間的HMGB1水平無統計學差異。結果表明中劑量和痹方與MTX更能有效的抑制研制因子IL-17與HMGB1表達。

CPA是新近研究發現的存在于中樞神經系統與免疫系統之間一條具有拮抗炎癥反應作用的通路。該通路由迷走神經及其遞質乙酰膽堿(Ach)所構成，Ach與免疫細胞表面的α7nAChR結合后通過調節下游NF-κB信號通路，抑制促炎因子的轉錄和合成，發揮抗炎作用。α7nAChR是CAP發揮作用的關鍵受體，膽堿能激動劑激活α7nAChR后，可抑制NF-κB p65的核轉移，從而抑制炎癥因子的生成。已有實驗證明，FLS表面存在α7nAChR的表達[2]，通過上調α7nAChR的表達可抑制FLS分泌炎癥因子。但目前尚無理想藥物能夠上調α7nAChR的表達。本實驗發現激動劑組、中劑量組可上調α7nAChR蛋白表達多，減少NF-kBp65蛋白表達；MTX組可降低NF-kBp65蛋白表達；激動劑組、中劑量組可促進α7nAChR mRNA的表達。表明中等濃度的和痹方具有上調α7nAChR mRNA與蛋白表達的作用，從而抑制NF-kB信號通路，降低炎癥因子IL-17、HMGB1等炎癥因子水平。

總之，復雜的細胞因子網絡是RA發生、發展的重要機制，和痹方劑能夠激活CAP，上調α7nAChR的表達，通過抑制上游的信號通路，從而降低下游炎癥因子水平，減輕關節破壞，為RA的治療開辟新的思路。