miRNA-138模擬物轉染對人乳腺癌細胞遷移、侵襲能力的影響及其機制

董超，黃遠麗，徐正豐

(華中科技大學同濟醫學院附屬荊州醫院，湖北荊州 434020)

乳腺癌是世界范圍內女性最常見的惡性腫瘤之一，我國是乳腺癌的高發區，每年新發病例數占全球新發病例的12.2%，死亡病例占全球乳腺癌死亡病例的9.6%，并且呈年輕化趨勢[1]。腫瘤的侵襲、轉移是患者致死的最重要原因之一，乳腺癌的侵襲、轉移是一個多基因參與，通過多步驟完成的復雜的過程，但其具體機制目前尚不清楚。微小RNA-138(miRNA-138)是家族重要成員之一，其在多種惡性腫瘤中呈低表達，在腫瘤的發生、侵襲及轉移過程中起重要的調控作用[2]。但至今，有關miRNA-138在乳腺癌中的研究甚少，并且miRNA-138對乳腺癌侵襲及遷移的作用及其機制尚不明確。本研究觀察了miRNA-138模擬物(miRNA-138 mimics)對人乳腺癌細胞遷移、侵襲能力的影響，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、miRNA-138模擬物及主要試劑 人高侵襲性乳腺細胞系MDA-MB-231、MDA-MB-468及人低侵襲性乳腺癌細胞系MCF-7[3]和人正常乳腺上皮細胞系HBL-100均購自美國ATCC細胞庫。miRNA-138模擬物(miRNA-138 mimics)及miR陰性對照模擬物(miR-NC)均購自上海吉瑪制藥技術公司。RPMI1640培養基、Transwell小室購自購自美國Corning公司，TRIzol試劑購自北京達科為生物公司，miRNA-138、U6引物購自廣州銳博生物公司，RNA逆轉錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒均購自美國Bio-Rad公司，Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司，基質膠購自美國BD公司，一抗SOX4、E-cadherin、Fibronectin、Vimentin和GAPDH均購自美國CST公司，二抗購自美國Santa Cruz公司。

1.2 MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7、HBL-100中miRNA-138檢測 將MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7、HBL-100培養于含10%胎牛血清的RPMI1460培養基中，在37 ℃、5%CO2的培養箱中培養。使用TRIzol試劑提取細胞總RNA，紫外分光光度計鑒定總RNA符合實驗要求，取100 ng總RNA，應用逆轉錄試劑盒逆轉錄得到cDNA。取cDNA和引物，配置PCR反應體系及反應參數，反應條件：94 ℃、2 min，94 ℃、20 s，60 ℃、30 s，共40個循環。miRNA-138引物序列：5′-AGCTGGTGTTGTGAATC-3′，5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。以U6作為內參基因，以2-ΔΔCt代表miRNA-138相對表達水平。

1.3 miRNA-138模擬物轉染及細胞分組 MDA-MB-231置入含10%胎牛血清的RPMI1460培養基中，在37 ℃、5%CO2的培養箱中培養。轉染前24 h，取生長情況良好的對數生長期細胞系接種于6孔細胞板，細胞融合度達70%～80%時采用Lipofectamine2000進行脂質體轉染，按照按試劑說明書，分別將miRNA-138 mimics(miRNA-138 mimics組)和miR-NC(miR-NC組)轉染至細胞中。轉染后繼續培養24 h，后收集細胞進行后續實驗。

1.4 轉染后的MDA-MB-231細胞miRNA-138檢測方法 采用qRT-PCR法。使用TRIzol試劑提取細胞總RNA，紫外分光光度計鑒定總RNA符合實驗要求，取100 ng總RNA，應用逆轉錄試劑盒逆轉錄得到cDNA。取cDNA和引物，配置PCR反應體系及反應參數，反應條件：94 ℃、2 min，94 ℃、20 s，60 ℃、30 s，共40個循環。miRNA-138 引物序列：5′-AGCTGGTGTTGTGAATC-3′,5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。以U6作為內參基因，miRNA-138相對表達水平應用2-ΔΔCt法計算。

1.5 轉染后的MDA-MB-231細胞侵襲和遷移細胞數測算 采用Transwell遷移及侵襲實驗。收集轉染24 h后的兩組MDA-MB-231細胞，用無血清DMEM培養基將兩組細胞重懸成為1×105個細胞/mL的細胞懸液，對細胞預先饑餓處理24 h。Transwell小室置于24孔細胞培養板內，小室底膜上室面均勻基質膠包被，Transwell小室上室加入200 μL兩組細胞懸液，下室加入600 μL含10%胎牛血清的DMEM培養基,常規培養24 h。取出Transwell小室，棉簽輕柔拭去上室面殘留細胞，4%多聚甲醛固定細胞30 min，染色。倒置顯微鏡下隨機選擇5個不重復的視野拍照并計數穿膜到下室面的細胞數目。進行Transwell侵襲實驗時，小室底膜的上室面不包被基質膠，其他操作與Transwell遷移實驗相同。

1.6 轉染后的MDA-MB-231細胞SOX4、E-cadherin、Fibronectin、Vimentin蛋白檢測 采用Western blotting法。取轉染后24 h的兩組細胞，抽取細胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。每孔取30 μg總蛋白上樣，經10%SDS-PAGE電泳分離，電轉移至PVDF膜，以5%脫脂奶粉封閉液搖床封閉1 h后，加入一抗SOX4、E-cadherin、Fibronectin、Vimentin 和GAPDH，次日洗膜后加入HRP標記的二抗，室溫孵育1 h，ECL顯影液顯影，以GAPDH作為對照，條帶灰度值采用Quality One分析。

2 結果

2.1 乳腺癌細胞系及正常乳腺上皮細胞系中miRNA-138相對表達量比較 MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7、HBL-100中miRNA-138相對表達量分別為0.23±0.08、0.42±0.05、0.56±0.11、1.03±0.04，MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7與HBL-100比較，MDA-MB-231、MDA-MB-468與MCF-7比較，P均<0.05。

2.2 兩組細胞系miRNA-138表達比較 miRNA-138 mimics組和miR-NC組miRNA-138相對表達量分別為13.35±0.35、0.98±0.05，兩組比較，P<0.05。

2.3 兩組細胞系遷移細胞數、侵襲細胞數比較 結果見表1。

表1 兩組細胞系遷移細胞數、侵襲細胞數比較(個，

注：與miR-NC組比較，*P<0.05。

2.4 兩組細胞系SOX4、E-cadherin、Fibronectin、Vimentin蛋白灰度值比較 結果見表2。

表2 兩組細胞系SOX4、E-cadherin、Fibronectin、Vimentin蛋白灰度值比較

注：與miR-NC組比較，*P<0.05。

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，近年來發病率呈逐年上升的趨勢，嚴重危害人民健康和生命。目前，臨床上主要采用手術、化療、放療及內分泌治療等綜合手段治療乳腺癌，雖然隨著醫療技術的發展，乳腺癌的診療技術得到不斷發展，但過去5年里乳腺癌的總生存率并沒有得到實質性提高[4]。乳腺癌的發生進展機制涉及多種信號通路異常和基因突變，目前尚未完全清楚。乳腺癌細胞系MDA-MB-231是從一名51歲的白人女性乳腺癌患者的胸水中分離建立的，該細胞表達表皮生長因子EGF受體、TGF-α受體和WNT7B癌基因，是被研究者廣泛應用的一種高侵襲性乳腺癌細胞模型[3]。

miRNA是近年來發現的一類約22個核苷酸長度的非編碼小分子單鏈RNA，通過降解靶基因mRNA或者抑制其翻譯，調控著人體約1/3基因的表達，參與多種疾病的發生發展過程，尤其在腫瘤細胞增殖、凋亡、侵襲遷移等生物學過程中發揮著重要的作用[5]。miRNA-138是近年來發現的腫瘤相關的miRNA分子成員之一。研究發現，miRNA-138在前列腺癌[6]、非小細胞肺癌[7]、食管鱗狀細胞癌[8]、宮頸癌[9]等多種惡性腫瘤中表達降低，作為抑癌基因抑制腫瘤細胞的侵襲與遷移。至今有關miRNA-138在乳腺癌中研究甚少。本研究顯示，miRNA-138在人乳腺癌細胞中的表達水平較人乳腺上皮細胞明顯降低，這說明miRNA-138在乳腺癌中也起著抑癌基因的作用，與miRNA-138在其他惡性腫瘤中的研究結果一致。進一步我們發現，miRNA-138在高侵襲性乳腺細胞中的表達較低侵襲性乳腺癌細胞明顯減低，提示miRNA-138可能與乳腺癌細胞的侵襲轉移能力有關。

侵襲、轉移是惡性腫瘤的重要的生物學特征，為了探討miRNA-138對乳腺癌細胞侵襲遷移能力的影響，我們應用脂質體轉染法成功將miRNA-138模擬物轉染至MDA-MB-231細胞中，成功建立過表達miRNA-138的乳腺癌細胞模型，Transwell遷移和侵襲實驗結果顯示，過表達miRNA-138的乳腺癌細胞穿膜細胞數明顯較對照組減少，提示過表達miRNA-138能夠明顯抑制乳腺癌細胞的侵襲及遷移能力。惡性腫瘤侵襲轉移的具體分子機制非常復雜，涉及血管形成、細胞黏附能力變化、上皮間質轉化(EMT)等多種因素，其中EMT是影響惡性腫瘤細胞侵襲轉移的關鍵啟動步驟[10,11]。

EMT是指在內外部因素的影響下，上皮細胞失去極性，細胞間緊密連接消失，獲得侵襲和遷移能力，轉化成為具有間質細胞特性細胞的過程[12]。研究[13,14]發現，EMT是惡性腫瘤發生侵襲轉移的重要步驟。細胞發生EMT的過程中，E-cadherin、α-catenin等上皮細胞源性標志物表達明顯缺失或降低，而Fibronectin、Vimentin、N-cadherin等間質細胞源性標志物表達明增加[15]。腫瘤細胞在發生EMT的過程中，E-cadherin 等細胞間隙黏連蛋白減少，腫瘤細胞形態發生改變，與此同時細胞侵襲及遷移能力也明顯增加[16]。既往研究表明，miRNA-138在腎透明細胞癌[17]和膽囊癌[18]能通過調控EMT抑制腫瘤細胞的侵襲與遷移，但miRNA-138對乳腺癌EMT的影響尚未見報道。本研究發現，過表達miRNA-138的乳腺癌細胞中上皮細胞源性標志物E-cadherin蛋白表達較對照組明顯升高，而間質細胞源性標志物Fibronectin、Vimentin蛋白表達的表達較對照組明顯降低，證實miRNA-138能夠通過抑制乳腺癌細胞EMT抑制乳腺癌細胞的侵襲及遷移能力。

SOX4屬于SOX家族的重要成員，其定位于人染色體6p22.3 上，在細胞分化的調控、胚胎發育及干細胞維持方面發揮著重要作用[19]。近年研究發現，SOX4在包括乳腺癌在內的多種惡性腫瘤中表達升高，作為原癌基因發揮作用。并且研究發現，SOX4與腫瘤細胞的EMT密切相關，是調控腫瘤細胞EMT的重要基因。在乳腺癌中也證實SOX4可以通過調控EMT促進乳腺癌細胞的侵襲轉移。近期Liu等[17]證實，miRNA-138能夠靶向調控SOX4基因的表達調控腎透明細胞癌EMT，從而影響腫瘤細胞的侵襲轉移能力。為了觀察在乳腺癌中miRNA-138是否也能夠調控SOX4基因表達影響腫瘤細胞的EMT，我們通過Western blotting檢測,發現過表達miRNA-138的乳腺癌細胞中SOX4蛋白的表達水平較對照組降低，證實miRNA-138可能通過調控SOX4基因調控乳腺癌細胞EMT過程，從而影響癌細胞的侵襲與遷移能力。

總之，miRNA-138 mimics能夠抑制乳腺癌細胞侵襲和遷移，其機制可能與調控SOX4基因抑制乳腺癌細胞EMT有關。miRNA-138有可能成為干預乳腺癌侵襲轉移能力的新的治療靶點，為乳腺癌的基因靶向治療提供新的方向。