miR-639在骨肉瘤組織中的表達及其模擬物轉染對人骨肉瘤細胞U20S增殖、遷移、侵襲能力的影響

張瓊，張琳，楊臻，陳楠

( 1天津市兒童醫院，天津 300074；2天津醫科大學代謝病醫院；3天津醫科大學腫瘤醫院)

骨肉瘤來源于原始成骨間充質細胞，是最常見的原發性惡性骨腫瘤[1]。骨肉瘤常發生于脛骨近端、肱骨、股骨遠端的干骺部，典型癥狀包括局部腫脹、關節活動受限、疼痛以及小梁骨受損[2,3]。骨肉瘤不僅惡性程度高，轉發和轉移率也很高[4]。骨肉瘤的年齡分布主要集中在10～20歲青少年和老年人群，呈現雙高峰分布狀態[5]。目前，對于骨肉瘤的治療主要包括手術切除聯合放化療[6]。雖然某些臨床研究提供了相關的手段進行診斷和治療，但效果仍不盡如人意，預后效果也較差，骨肉瘤患者的五年生存率僅為60%～70%，轉移性骨肉瘤患者的臨床預后效果更差[7]。因此，探索一種新的特異性的骨肉瘤診療標志物是目前的重中之重。研究[8～10]表明，微小RNA(miRNA)在腫瘤的發生發展中通過調控不同的生物過程而發揮重要的作用，包括細胞的增殖、凋亡、代謝以及轉移等。文獻[11,12]報道，miR-639在甲狀腺癌和乳腺癌中起促癌基因的作用。但是，miR-639在骨肉瘤中的研究尚未見相關文獻報道。本研究觀察了miR-639在骨肉瘤組織中的表達情況，另觀察了miR-639模擬物(miR-639 mimics)轉染對人骨肉瘤細胞U20S增殖、遷移、侵襲能力的影響，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑及miR-639模擬物 U20S細胞購自中國科學院細胞庫；胰蛋白酶、細胞培養基DMEM和胎牛血清均購自美國Gibco公司；總RNA提取試劑TRIzol、蛋白裂解液RIPA、Lipofetamine 2000轉染試劑均購自美國Invitrogen公司；反轉錄試劑盒TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit、熒光定量PCR試劑盒SYBR Premix EX TaqTM ⅡPCR Kit均購自日本Takara 公司；細胞計數試劑盒Cell Counting Kit-8、EdU試劑盒均購自Sigma公司；Transwell小室購自美國密理博Millipore公司；抗TUSC5單克隆抗體、抗GAPDH多克隆抗體均購自Abcam公司；miR-639 mimics及模擬物陰性對照(miR-NC)合成于上海吉瑪基因公司。

1.2 骨肉瘤、癌旁組織miR-639分析 直接提取NCBI-GEO和TCGA公共數據庫中的測序數據，并采用GraphPad軟件作圖，根據數據庫的數據資料分析骨肉瘤、癌旁組織miR-639的相對表達量。

1.3 U20S細胞培養、分組及miR-639 mimics轉染 取U20S細胞，培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，在37 ℃、5%CO2的培養箱中培養。轉染前24 h，取生長情況良好的對數生長期細胞，接種于6孔細胞板，細胞融合度達70%～80%時，采用Lipofectamine2000進行脂質體轉染，按照按試劑說明書，將miR-639 mimics和miR-NC轉染入U20S細胞中(分別計為觀察組和對照組)，轉染后繼續培養24 h，后收集細胞進行后續實驗。

1.4 U20S細胞增殖、遷移、侵襲能力觀察 ①細胞增殖能力：1.克隆形成實驗：細胞轉染后24 h進行消化計數，取5×102個細胞接種于12孔板中，在37 ℃、5%CO2條件下繼續培養，每3 d更換1次培養液。14 d后用結晶紫染液染色10 min，用輕緩的水流將結晶紫沖洗干凈。用成像系統拍照后，計數形成的克隆數(個)。2.EdU增殖實驗：細胞轉染后24 h進行消化計數，取5×104個細胞接種于12孔板中，在37 ℃、5%CO2條件下繼續培養48 h。按照廣州銳博生物公司提供的試劑盒實驗步驟進行EdU實驗。拍照后，計數被染成紅色的細胞數(個)。②細胞遷移能力：采用Transwell遷移細胞實驗。胰酶消化細胞后用無血清培養液重懸細胞，進行細胞計數后將細胞數量調整為30×104/mL，取200 μL加在小室上層，取800 μL含20%血清的DMEM加入小室下層，置于37 ℃、5%CO2孵箱中繼續培養。72 h后取出小室，PBS清洗兩遍，每孔加入固定液(甲醇∶冰醋酸為3∶1)1 mL，固定30 min，棉簽擦除小室內未穿過的細胞，結晶紫染色10 min，清水沖洗后棉簽擦除小室內殘余的結晶紫，用中性樹脂固定于載玻片上。倒置顯微鏡下隨機選擇5個不重復的視野拍照并計數穿膜到下室面的細胞數(個)。③細胞侵襲能力：采用Transwell細胞侵襲實驗。提前4 h向用于Transwell侵襲實驗的小室中加入45 μL的Matrigel膠，并置于37 ℃孵箱凝膠。胰酶消化細胞后用無血清培養液重懸細胞，進行細胞計數后將細胞數量調整為30×104/mL，取200 μL加在小室上層，取800 μL含20%血清的DMEM加入小室下層，置于37 ℃、5%CO2孵箱中繼續培養。72 h后取出小室，PBS清洗兩遍，每孔加入固定液(甲醇∶冰醋酸為3∶1)1 mL，固定30 min，棉簽擦除小室內未穿過的細胞，結晶紫染色10 min，清水沖洗后棉簽擦除小室內殘余的結晶紫，用中性樹脂固定于載玻片上。倒置顯微鏡下隨機選擇5個不重復的視野拍照并計數穿膜到下室面的細胞數(個)。

1.5 U20S細胞TUSC5 mRNA、蛋白檢測 ①TUSC5 mRNA：采用熒光定量PCR法。對轉染48 h后的貼壁U20S細胞依照TRIzol試劑盒說明書進行總RNA提取。提取RNA后遵照TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit 試劑盒說明將RNA逆轉錄為cDNA，剩余的RNA存于-80 ℃備用。紫外分光光度計鑒定總RNA符合實驗要求，取100 ng總RNA，應用逆轉錄試劑盒逆轉錄得到cDNA。配置PCR反應體系及反應參數，反應條件：94 ℃、2 min，94 ℃、20 s，60 ℃、30 s，共40個循環。TUSC5引物序列： 上游引物5′GCACAGACTCAAAGGGAAACC3′，下游引物5′ACCTAAGCAGCACCAGACG3′；GAPDH引物序列：上游引物5′GACTTCAACAGCGACACCC 3′；下游引物5′AGGTGCGGCTCCCTAGGCCCCTCCC3′。以GAPDH作為內參基因，以2-ΔΔCt代表TUSC5相對表達水平。②TUSC5蛋白：采用Western blotting法。細胞轉染48 h后，使用RIPA裂解液裂解細胞，提取細胞蛋白質。取約30 μg蛋白進行10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，TUSC5抗體和GAPDH抗體以1∶2 000比例進行孵育，4 ℃過夜。TBST洗膜4次，每次5 min，加入HRP標記的二抗(1∶5 000)，室溫孵育2 h，TBST洗膜4次，每次5 min，ECL發光法顯影曝光。以GAPDH作為對照，條帶灰度值采用Quality One分析。

2 結果

2.1 骨肉瘤、癌旁組織中miR-639表達比較 GEO數據庫顯示，骨肉瘤、癌旁組織中miR-639表達水平分別為11.2±0.4、7.1±0.6，兩者比較，P<0.05；TCGA數據庫顯示，骨肉瘤、癌旁組織中miR-639表達水平分別為19.5±3.4、7.7±2.2，兩者比較，P<0.05。

2.2 miR-639高表達與骨肉瘤臨床病理參數的關系 由表1可知，miR-639高表達與骨肉瘤腫瘤直徑、淋巴結轉移、解剖部位有關(P均<0.05)。

表1 miR-639高表達與骨肉瘤臨床病理參數的關系

2.3 兩組細胞增殖能力比較 觀察組、對照組集落形成數分別為(155±12)、(84±8)個，兩組比較，P<0.05；EdU染色細胞數分別為(14±3)、(6±2)個，兩組比較，P均<0.05。

2.4 兩組遷移細胞、侵襲能力比較 觀察組和對照組遷移細胞數分別為(120±30)、(70±18)個，兩組比較，P<0.05；觀察組和對照組細胞侵襲數分別為(100±16)、(52±23)個，兩組比較，P均<0.05。

2.5 兩組TUSC5 mRNA、蛋白表達比較 觀察組和對照組TUSC5 mRNA分別為0.18±0.07、0.84±0.13，TUSC5蛋白分別為0.31±0.06、0.81±0.09，兩組比較，P均<0.05。

3 討論

骨肉瘤是最常見的原發性惡性骨腫瘤，主要影響兒童和年輕人，特征是與骨質溶解相關的骨樣新生成，主要發生在長骨的干骺端[13,14]。目前，骨肉瘤的治療方法通常基于手術和化療的結合，5年生存率為60%～70%，但患者的化療抵抗和局部復發或遠處轉移擴散非常普遍[15]。目前，臨床上藥物的毒性閾值和肺轉移的存在是治愈骨肉瘤的兩個主要障礙[16]。盡管科學家們一直進行治療優化的努力，轉移性的擴散仍然極大地損害了癌癥患者的生存，因此需要更好地理解其發生發展的內在機制。

miRNAs通過調控多個靶基因的表達發揮生物功能，以往對于miR-639靶基因的研究較少。最新研究[17,18]表明，miR-639可以促進鼻咽癌細胞的增殖和遷移能力，另外miR-639可以在前列腺癌中作為一種新的分子標志物。本研究顯示，miR-639在骨肉瘤中高表達，且其高表達與腫瘤直徑、淋巴結轉移和TNM分期相關，由于樣本量較小，相關性不是很顯著，今后可以擴大樣本量再進行深度分析。已有研究表明，miR-639可以顯著促進甲狀腺癌和乳腺癌的增殖和轉移，因此我們研究分析了miR-639對U20S細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響。CCK8實驗、克隆形成實驗以及EdU嵌合實驗證明，miR-639可以顯著促進U20S細胞的增殖能力，Transwell實驗證明miR-639可以顯著促進U20S細胞的遷移和侵襲能力。提示miR-639可能是骨髓瘤治療的重要靶點。miRNA一般是通過調控靶基因表達發揮作用，因此本研究通過軟件對miR-639新的靶基因進行了預測，我們首先miR-639可以靶向調控TUSC5基因，通過數據庫預測miRNAs靶基因的結果可能存在假陽性。因此，我們進一步通過實驗進行了驗證，熒光報告載體實驗結果表明miR-639可以抑制TUSC5的mRNA和蛋白水平的表達，證明miR-639在轉錄水平上對TUSC5確實具有調控作用。

TUSC5基因是最新發現的抑癌基因，在乳腺癌中低表達，是乳腺癌不良預后的新的生物標志物，另外MiR-3188可以靶向TUSC5調控乳腺癌的增殖、遷移和凋亡[19,20]。本研究顯示，觀察組TUSC5 mRNA和蛋白低于對照組。因此我們推測，miR-639也可能通過抑制TUSC5基因對骨髓瘤細胞的凋亡發揮重要調控作用，下一步需要進行進一步實驗驗證。

總之，miR-639在骨肉瘤組織中表達升高；miR-639 mimics促進了骨肉瘤細胞的增殖、遷移、侵襲能力，可能與抑制TUSC5有關。