輔助生殖技術中短時受精失敗結合早期補救ICSI與常規ICSI的臨床結局分析

王紫娟,游 敏,張紅梅,王麗媛,土增榮,田秀珠*

(1山西醫科大學第一臨床醫學院生殖中心,太原 030001;2山西醫科大學第一醫院生殖中心;*通訊作者,E-mail:2250143701@qq.com)

在體外受精-胚胎移植(invitrofertilization-embryo transfer,IVF-ET)的治療過程中,受精失敗是導致周期取消的主要原因之一,約占IVF-ET治療患者中的10%-15%[1],包括完全受精失敗和部分受精失敗。完全受精失敗指全部卵母細胞均未受精,部分受精失敗指多于75%的卵母細胞未受精[1]。受精失敗或低受精率的發生不僅會減少胚胎形成數,甚至可導致無可移植胚胎,浪費患者取出的卵母細胞,而且嚴重影響IVF-ET的臨床妊娠率和累積妊娠率,并增加患者的心理壓力和經濟負擔。多年來受精失敗是輔助生殖技術領域中許多臨床醫生和胚胎實驗室專家亟待解決的問題之一。為了減少IVF-ET受精失敗的發生,目前國內外大多數胚胎學專家選擇采用短時受精結合早期補救ICSI的方法[2,3],即受精后5-6 h觀察是否釋放第二極體以判斷是否受精,若未見第二極體釋放則判斷為未受精,并對受精率低于50%的未受精卵子即刻行補救ICSI。隨著該技術手段的出現及應用,有效防止了一部分體外受精失敗或低受精率的發生,減少了因無可移植胚胎而導致的周期取消,并獲得了滿意的臨床妊娠結局。本次研究通過對76例短時受精失敗結合早期補救ICSI周期與464例常規ICSI周期進行比較,探討短時受精失敗結合早期補救ICSI對降低受精失敗率和改善妊娠結局的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象 回顧性分析2012-01～2016-10在山西醫科大學第一醫院生殖中心首次行IVF-ET或ICSI助孕治療的540對不孕夫婦的病歷資料。

1.1.2 分組標準 根據是否實施早期補救ICSI進行分組,研究組為短時受精失敗結合早期補救ICSI組(76例),納入標準:常規IVF受精后5-6 h,觀察第二極體,對排出第二極體比例少于50%的未受精MⅡ期卵子行早期補救ICSI。對照組為常規ICSI組(464例),納入標準:①男方嚴重少、弱、畸精子癥;②梗阻性無精癥;③生精功能障礙(排除遺傳缺陷);④男性免疫性不育;⑤IVF-ET受精失敗;⑥精子無頂體或頂體功能異常。對比分析兩組患者的一般資料、胚胎發育情況、妊娠情況和新生兒出生情況。本課題已經通過山西醫科大學第一醫院生殖醫學倫理委員會的審核。

1.2 方法

1.2.1 控制性卵巢刺激方案及取卵 540對夫婦女方均采用促性腺激素釋放激素-激動劑(gonadotropin releasing hormone-agonist,GnRH-a)長方案超促排卵,于降調日注射長效制劑(達菲林)1.25-1.8 mg,或每天注射短效制劑(達必佳或達菲林)0.1 mg或0.05 mg至人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)扳機日。垂體降調滿意后給予促性腺激素(gonadotropin,Gn)促排卵治療,根據患者個體情況、陰道B超、血清E2、P水平評估患者卵巢反應性和卵泡生長發育情況,及時調整Gn用量。當至少有一個卵泡直徑≥18 mm或3個卵泡直徑≥17 mm時,結合血清E2水平給予注射5 000-10 000 IU HCG。HCG扳機后34-36 h于陰道超聲下行陰道后穹隆穿刺取卵。

1.2.2 卵母細胞的處理 卵母細胞預處理后,在受精用培養基內預培養2 h。常規ICSI組需在進行ICSI操作前,采用透明質酸酶和機械法去除卵子周圍包繞的顆粒細胞,然后置入培養液中待用。

1.2.3 精液收集及處理 男方禁欲3-5 d,于女方取卵術后2 h內手淫取精,將精液置入無菌、無毒、標記有患者雙方姓名的取精杯內,核對患者信息后保存精液。待精液液化后行精液常規分析,采用Pureception密度梯度離心法優化處理精液。

1.2.4 授精方法及受精評估 短時受精:調整受精液中精子密度為(5-10)×105/ml,將其加入預先準備好的培養皿中使精卵發生受精,并放入培養箱中培養。受精后5-6 h用機械法去除卵母細胞周圍的卵丘及顆粒細胞,拆卵后將其移到胚胎培養皿中以便于觀察受精情況,卵周間隙可見第二極體認為受精,反之認為未受精,對受精率小于50%的未受精卵子及早行補救ICSI。

常規ICSI:選擇精子并制動,將選好的卵母細胞置入ICSI培養皿,調整卵子位置使第一極體位于6點或12點處,將精子注入卵胞漿內,注射后的卵子移入卵裂培養基中繼續培養。16-18 h后觀察原核判斷受精情況,精原核及卵原核的形成標志受精過程完成,卵細胞內可見兩個原核、卵周間隙可見2個極體為正常受精,大于2個原核為多精受精。

1.2.5 胚胎培養和移植、黃體支持 胚胎培養和移植:胚胎實驗室工作人員在取卵術后42 h、72 h觀察卵裂期胚胎形態及細胞數目,標記多精受精胚胎,對第3天胚胎進行形態學評估;取卵術后72 h,選擇1-2枚形態學評分較高且卵裂球形態較規則胚胎移植入宮腔。黃體支持:女方自取卵當日開始肌注黃體酮注射液(60 mg/次,1次/d)、口服地屈孕酮片(達芙通)(10 mg/次,2次/d),至移植后14 d查血或尿HCG。

1.2.6 妊娠結局判斷 胚胎移植后2周,女方化驗尿或血HCG,若為陽性,移植后4周行盆腔超聲檢查,若未探及妊囊,復查血HCG值升高不明顯或者下降者考慮生化妊娠;若探及妊囊、胎芽及原始心管搏動即為臨床妊娠;若盆腔超聲提示宮外孕可能,結合血HCG值及腹腔鏡檢查結果可診斷異位妊娠。宮內妊娠12周前自然流產,診斷為早期流產;宮內妊娠滿12周及以上不足28周、胎兒體重小于1 000 g自然流產者為晚期流產;妊娠滿28周但不足37周分娩,診斷為早產;妊娠28周以上或出生體重超過1 000 g,娩出活嬰者,診斷為活產;新生兒出生體重小于2 500 g,診斷為低出生體重兒。

1.3 統計方法

2 結果

2.1 一般情況的比較

研究組和對照組女方年齡、不孕年限、基礎促卵泡生成素(FSH)、基礎黃體生成素(LH)、基礎雌二醇(E2)、基礎孕酮(P)、總Gn用量、獲卵數和移植日子宮內膜厚度等一般資料差異均無統計學意義(P>0.05,見表1)。

項 目研究組對照組t或ZP女方年齡(歲)不孕年限(年)基礎FSH(mIU/ml)基礎LH(mIU/ml)基礎E2(pg/ml)基礎P(ng/ml)總Gn用量(IU)獲卵數(枚)移植日子宮內膜厚度(mm)30.07±3.80 4.97±3.127.15±2.904.94±4.7034.9(0,49.3)? 0.43(0.31,0.75)?2658.75±943.19 17.11±6.0710.98±2.7629.61±4.30 4.62±3.16 8.14±6.02 4.65±4.5635.1(0,50.05)? 0.46(0.31,0.80)? 2928.14±1926.0715.79±8.5110.58±2.380.8770.9171.3540.5080.159#0.428#1.1951.2961.3060.3810.3590.1760.6120.8740.6680.2320.1960.192

*為中位數(Q1,Q3);#采用Mann-WhitneyU秩和檢驗

2.2 受精和胚胎發育情況比較

研究組受精率、多精受精率和優質胚胎率明顯高于對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。兩組間受精數、卵裂率、可利用胚胎率、冷凍胚胎率、周期取消率和胚胎種植率等指標比較差異無統計學意義(P>0.05,見表2)。

2.3 臨床妊娠結局和新生兒出生情況的比較

兩組間生化和臨床妊娠率、異位妊娠率、早期和晚期流產率、早產率、活產率、雙胎出生率、低體重兒出生率和新生兒胎齡等比較,差異均無統計學意義(P>0.05,見表3)。

3 討論

近年來人類輔助生殖技術的廣泛應用,為越來越多的不孕癥夫婦帶來了福音。但此項技術發展至今仍有一些不足之處,如:在IVF-ET治療過程中,其平均受精率僅為70%左右,即10%-15%會發生受精失敗或低受精率[1]。造成這種不良結局的影響因素很多,主要表現在以下三個方面:(1)男方因素:①精子透明帶結合與穿透異常,是受精失敗的主要原因;②精子缺少與卵子質膜融合的相關受體或因子(較罕見);③精子原因所致卵子激活障礙[1,4-8]。(2)女方因素:①卵母細胞透明帶增厚或硬化等結構異常;②卵母細胞膜上缺乏精子受體;③卵細胞胞質或細胞核不成熟;④卵細胞胞質功能障礙導致卵子激活失敗;⑤卵子MⅡ期阻滯導致卵子激活障礙[1,8-12]。(3)其他因素,如:①實驗室環境(空氣、溫度、pH值、光線)、IVF-ET的技術操作等外界因素會影響卵子受精能力;②實驗室人員對卵子質量和成熟程度的判斷失誤也會導致受精失敗[1]。既往對受精失敗的處理是通過觀察IVF加精后18-20 h原核的形成判斷受精情況,并對受精失敗卵子進行晚補救ICSI。研究發現此種方法雖可提高受精率和卵裂率,但臨床妊娠率和出生率極低[13],可能原因有:①卵母細胞老化,錯過了最佳受精時限,從而影響胚胎發育潛能;②卵母細胞暴露于培養基中的時間延長,精子顆粒細胞產生的活性氧等有害代謝物質會對細胞膜及DNA產生不利影響,即使ICSI后也不會有正常的胚胎發育;③卵母細胞極體位置可能發生改變,ICSI操作可能損傷紡錘體,導致胚胎染色體異常;④胚胎與子宮內膜發育不同步,錯過了子宮內膜種植窗[13]等。由于晚補救ICSI臨床應用價值較低,現已極少應用。2003年新加坡格倫伊格爾斯醫院生殖醫學中心的Chen教授等[14]首次提出早期補救ICSI(early rescue ICSI),并將其應用于臨床實踐。早期補救ICSI是在加精后6 h觀察第二極體是否釋放預測是否受精,若僅見單個極體的卵子則行ICSI。南京大學醫學院附屬鼓樓醫院生殖醫學中心曾報道受精后6 h約90%的卵母細胞排出第二極體[1],因此第二極體是早期判斷卵母細胞受精的金標準。常規IVF加精5-6 h后剝除顆粒細胞,觀察受精情況,對排出的第二極體數少于成熟卵子數50%的未受精卵子則行ICSI。近年來多數研究結果表明,早期補救ICSI手段的應用,避免了完全性受精失敗,在一定程度上改善了IVF-ET的胚胎發育潛能和妊娠結局[14,15]。

表2受精和胚胎發育情況的比較

Table2Comparisonoffertilizationandembryodevelopment

指標研究組對照組t或χ2 P MⅡ卵母細胞數受精卵數2PN卵裂數2PN受精卵數受精數受精率(%)多精受精率(%)卵裂率(%)可利用胚胎率(%)優質胚胎率(%)冷凍胚胎率(%)周期取消率(%)胚胎種植率(%)76154276454210.91±5.3685.28(649/761)6.57(50/761)140.96(764/542) 65.58(501/764)38.74(296/764)48.82(373/764)18.42(14/76) 33.59(43/128) 621840794557407910.36±7.0671.23(4429/6218)1.58(98/6218) 111.72(4557/4079) 64.21(2926/4557)30.74(1401/4557)47.66(2172/4557)23.06(107/464) 27.19(205/754) - - - -0.7934.9713.2890.5380.8732.1920.3920.8081.415 - - - -0.4290.0000.0020.5910.3850.0290.6950.3690.160

表3妊娠結局和新生兒出生情況的比較

Table3Comparisonofpregnancyoutcomesandneonatalbirthsbetweentwogroups

指標研究組對照組t或χ2P 臨床妊娠周期數移植周期數活嬰數生化妊娠率(%)臨床妊娠率(%)異位妊娠率(%)早期流產率(%)晚期流產率(%)早產率(%)活產率(%)雙胎出生率(%)低體重兒出生率(%)新生兒胎齡(周)316121 0(0/61)50.82(31/61)9.68(3/31)25.81(8/31) 0.03(1/31)19.05(4/21) 34.43(21/61)38.10(8/21) 13.79(4/29) 37.95±0.40 1563551242.54(9/355) 43.94(156/355)5.77(9/156)16.03(25/156)1.92(3/156)14.05(17/121) 34.93(124/355)30.65(38/124)16.05(26/162)38.12±0.18 - - -0.5491.4830.4642.1760.0950.0270.4580.6610.398 - - -0.4590.2230.4960.1400.456#0.7580.8690.4990.5090.691

#為Fisher’s檢驗

早期補救ICSI組與常規ICSI組相比是否可獲得更高的受精率,目前文獻報道結論不一致[16,18]。本研究結果顯示:早期補救ICSI組受精率(85.28%)明顯高于常規ICSI組(71.23%),差異有統計學意義(P<0.05),與彭鵬等[16,19,20]研究結果相近。羅海寧等[7]認為ICSI受精失敗主要原因為卵母細胞未激活,卵細胞質與細胞核成熟不同步可能發生早熟染色體凝集(premature chromosome condensation,PCC)及原核形成或遷移障礙。劉輝等[21]和宋明哲等[22]的研究結果均表明隨卵母細胞成熟率的下降受精率也隨之下降。考慮本研究早期補救ICSI組受精率高是由于其ICSI穿刺時間較常規ICSI組晚5-6 h,此時卵母細胞發育更成熟,更有利于受精成功。卵母細胞成熟包括了細胞核和細胞質的共同成熟,并且只有核質共同成熟的卵母細胞才具備繼續發育的潛能。大多數報道指出卵細胞質成熟比細胞核成熟晚,且卵細胞質成熟需要經歷一系列復雜生理生化過程,如:皮質顆粒數量和分布的改變、線粒體重排、鈣釋放、透明帶成熟等,這些反應過程對卵母細胞受精和胚胎發育有著重要作用[1]。因此,結合卵母細胞核質發育不同步的特性,可能早期補救ICSI組再受精時卵母細胞核質發育更同步,卵細胞質更成熟,為受精所做的準備工作也越完善。而且臨床工作中胚胎實驗室人員僅僅依據卵母細胞的形態學表現評估其成熟度,所以該評估方法對卵母細胞成熟度的判斷不一定準確,常規ICSI穿刺時可能存在部分形態學成熟而實際并未成熟的卵子,早期補救ICSI可能在一定程度上會減少這種失誤。

多精受精是較常見的一種異常受精現象。自然情況下,多精受精率僅為1%,而IVF時多精受精率可高達2%-10%[23]。本研究發現早期補救ICSI組的多精受精率(6.57%)顯著高于常規ICSI組(1.58%),與相關研究結果相近[2]。分析早期補救ICSI組多精受精率高的原因可能有:①早期剝除顆粒細胞:顆粒細胞在受精前和受精過程中,有誘導精卵結合、精子穿透、防止多精受精和幫助卵子正常受精的作用,短時受精過程中機械性剝除顆粒細胞可能損傷卵母細胞和透明帶等結構,殘留在透明帶上的精子可通過缺口再次進入卵子,而且卵子提早脫離了顆粒細胞存在的微環境也會影響正常受精,增加多精受精的機率[24,25]。②實驗室人員誤判:由于卵子成熟程度不同,IVF受精后6 h,約10%的卵母細胞存在第二極體延遲排出的現象,實驗室人員對這部分未觀察到第二極體釋放的卵母細胞進行重復受精增加了多精受精率;有時排出的第二極體很難與碎片樣第一極體鑒別,導致實驗室人員判斷失誤,對實際已受精的卵行ICSI也會增加多精受精率[26,27]。③ICSI操作損傷:ICSI穿刺可能對卵胞質內的紡錘體及微管、微絲等造成損傷,導致第二極體排出障礙或染色體分離異常[28],從而增加多精受精率。④實驗室人員技術水平和人為因素:實驗室人員的技術水平及經驗也至關重要,若實驗室胚胎學專家能夠盡量減少對受精情況判斷的失誤率和人為操作對卵母細胞的影響,將在一定程度上降低多精受精率,提高2PN率。多精受精會減少卵子利用率和可利用胚胎率。為了降低多精受精率,有學者提出若受精后5-6 h不能確定卵子是否受精,1-2 h后再次觀察極體和碎片的大小、形態、位置變化情況綜合評估受精情況,可減少因誤判導致多精受精[29],但受精后8 h發現卵子未受精,此時卵子可能錯過最佳受精時間,進而影響臨床妊娠率[30]。也有學者發現應用紡錘體觀察儀可減少異常受精,增加正常受精數和可移植胚胎數,并提高胚胎質量[30,31]。也有學者認為可以利用顯微外科方法移去第二個雄原核解決3PN,但該方法目前極少應用,安全性有待研究[3]。總之,多精受精作為早期補救ICSI過程中主要的異常受精情況,減少了可利用胚胎比例,所以實際工作中臨床醫師及實驗室人員應正確判斷受精情況盡量避免多精受精的出現。

關于早期補救ICSI組與常規ICSI組優質胚胎率的比較,研究者結論不一致。劉景等[29]和張曦倩等[32]認為早期補救組的優質胚胎率與常規ICSI組差異無統計學意義,但張曦倩等[32]研究表明早期補救ICSI組優質胚胎率較常規ICSI組高。然而羅平等[33]認為早期補救ICSI周期的優質胚胎率較常規ICSI周期顯著降低。本研究結果發現早期補救組的優質胚胎率高于對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。分析早補救ICSI組優質胚胎率高原因可能有:①卵母細胞成熟率下降可導致優質胚胎率降低[21,22],因為早期補救ICSI穿刺時間較常規ICSI遲5-6 h,此時成熟卵子數更多,卵母細胞胞質及胞核發育更同步,受精后胚胎發育潛能較常規ICSI組好;②短時受精過程中,在拆顆粒判斷受精情況之前,卵子周圍存在的顆粒細胞可分泌生長因子、氨基酸等促進早期胚胎發育的物質,也可代謝去除重金屬二價陽離子、葡萄糖等對早期胚胎發育不利的物質[33-37];③顆粒細胞長期存在對胚胎發育有不利影響,而早補救過程去除了顆粒細胞對胚胎的這種影響[33]。所以本研究認為早期補救ICSI不僅提高了受精率,而且提高了胚胎質量,增加患者妊娠機會,有一定的臨床意義,值得臨床推廣。

本研究發現兩組的臨床和生化妊娠率、異位妊娠率、早期和晚期流產率、早產率、活產率、雙胎出生率、低體重兒出生率、新生兒胎齡等比較差異無統計學意義,與于洪君等[17]研究的結論相同。兩組間妊娠結局無統計學差異可能與早期補救ICSI組樣本含量少有關。早期補救ICSI技術安全性問題目前尚無定論,有學者[37]認為早期補救并未對新生兒產生不利影響;也有學者[38]認為ICSI胎兒中染色體異常主要與父親染色體異常有關;本研究兩組中均未納入父親染色體異常患者,認為早期補救ICSI并未增加新生兒安全風險,與譚艷等[39]研究結果一致。因此,早期補救ICSI技術可作為短時受精失敗預防措施,臨床結局令人滿意,有臨床推廣價值。

綜上所述,為減少IVF-ET過程中受精完全失敗和受精低下現象的發生,對未受精卵子及早行補救ICSI,不僅避免了IVF-ET治療周期中完全受精失敗情況的發生,而且提高了受精率和優質胚胎率,并增加了患者的妊娠機會,獲得了與常規ICSI相當的妊娠結局,而且在一定程度上明確了IVF-ET受精失敗原因和早期補救ICSI的適應證,避免了ICSI選擇的擴大化。將來若胚胎實驗室專家能進一步減少多精受精率的發生,在挽救IVF受精失敗方面短時受精失敗結合早期補救ICSI的優勢將會進一步提升。所以如何更好地運用短時受精失敗結合早期補救ICSI技術對體外受精失敗的卵母細胞進行補救受精,以獲得更好的臨床結局,仍需要廣大生殖醫學專家進一步研究和探討。