Eag1基因在人宮頸良惡性病變組織中的表達及其意義

張 蘭,溫路生,林月麗,鄒雙優,尹 晶,陳 慧*

(1廈門大學附屬東南醫院婦產科,漳州 363000;2廈門大學附屬東南醫院病理科;*通訊作者,E-mail:chenhui175@163.com)

宮頸癌(cervical cancer,CCa)是女性常見惡性腫瘤之一,病因尚未完全明確,大量的臨床資料顯示早婚、早育、多產及性生活紊亂等的婦女罹患宮頸癌的幾率明顯增高。目前宮頸癌病死率居于婦科惡性腫瘤的第2位,嚴重影響婦女的心身健康和生活質量[1]。因此,如何早期診斷、及時治療宮頸癌具有重要的臨床意義。近年來研究發現,電壓門控型鉀離子通道的亞型—Eag1通道僅在人腦組織中高表達,但卻異常表達于如乳腺癌、卵巢癌、胃癌、結腸癌、軟組織肉瘤等多種惡性腫瘤中并與這些腫瘤的發生和進展密切相關,已成為一個新興的腫瘤分子治療靶點[2-4]。目前關于Eag1基因與宮頸癌的研究較少,Eag1基因在宮頸癌中的表達、作用及意義尚不明確。本研究旨在探討Eag1基因在不同宮頸病變組織中的表達情況,及與宮頸癌患者臨床分期、預后的關系,為宮頸癌的靶向治療提供一定的理論依據。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

隨機選取(電腦隨機選取此期間的宮頸癌患者ID號)2013-01～2018-01期間在解放軍第一七五醫院暨廈門大學附屬東南醫院婦產科診治的共105例宮頸病變病例,所有標本最終均經本院病理科病理診斷證實。該研究由我院醫學倫理研究委員會嚴格審查,患者被告知使用標本并在該研究前簽署知情同意書。選取宮頸上皮內瘤變CIN 30例(其中CIN1級、2級、3級各10例),宮頸鱗癌45例(其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期各10例,Ⅳ期15例)。另取因子宮肌瘤等行全子宮切除的瘤旁正常宮頸組織病例30例。將每個樣本平均分為兩份,并在-70 ℃冷凍,一份用RT-PCR檢測,另一份用4%甲醛固定,嵌入石蠟,切片厚度4 μm,最后進行免疫組織化學染色。

1.2 試劑與方法

Eag1抗體購自美國Thermo Fisher公司,按試劑盒說明書進行免疫組化操作。從美國的Santa Cruz公司購買了辣根過氧化物酶偶聯山羊抗兔血色素抗體;從上海Sangon公司購買了ECL化學發光試劑盒。

1.3 免疫組化檢測Eag1的蛋白表達

石蠟包埋組織連續切片(厚度4 μm),脫蠟,水化,PBS沖洗3×5 min后置于10 mmol/L檸檬酸緩沖(pH 6.0)中在高溫和高壓下修復抗原后。冷卻至室溫,再次用PBS沖洗3次。滴加一抗50 μl(兔抗人Eag1鉀通道抗體,稀釋濃度1 ∶200)在4 ℃下過夜。37 ℃復溫45 min,PBS沖洗3次。DAB-H2O2孵育5-10 min(在顯微鏡下掌握染色程度),PBS沖洗10 min,蘇木精染色,脫水,透明,封片。陰性對照組用PBS代替原抗體。陽性結果表明:1號鉀通道蛋白的陽性表達為透明褐色,背景明顯,位于細胞質和細胞膜中。統計標準參考文獻[5]的方法,根據陽性細胞數和陽性染色強度,分為0,1,2,3分。0分為少于10%的細胞染色陽性,1分為大于10%的細胞呈弱陽性染色,2分為大于10%的細胞呈中等陽性染色,3分為大于10%的細胞呈強陽性染色。其中0分為陰性表達,1,2,3分為陽性表達。1分為弱陽性表達,2和3分為強陽性表達。

1.4 統計學分析

用SPSS 19.0統計軟件進行統計分析。對所得數據進行了卡方檢驗和Fisher’s精確檢驗。P<0.05認為差異具有統計意義。

2 結果

2.1 Eag1在宮頸癌中的表達升高

30例子宮肌瘤正常宮頸組織中,2例Eag1為陽性表達(6.7%),其余均為陰性表達。30例宮頸上皮內瘤變標本中,3例CIN 3級標本中Eag1為陽性表達,3例CIN 2級標本中Eag1為陽性,2例CIN 1級標本中Eag1為陽性表達,陽性表達率為26.7%(見圖1)。45例宮頸癌組織標本中,38例標本中Eag1為陽性表達,陽性表達率為84.4%(見圖2)。與正常宮頸組織、宮頸上皮內瘤變組織相比,Eag1在宮頸癌組織的表達明顯升高,差異具有統計學意義(P=0.030)。

2.2 Eag1在宮頸癌組織中的表達強度與臨床分期有關

10例Ⅰ期的宮頸癌組織中,2例為Eag1陰性表達,4例為Eag1弱陽性表達,4例為Eag1強陽性表達,陽性表達率為80%,強陽性表達率為40%。10例Ⅱ期的宮頸癌組織中,1例為Eag1陰性表達,4例為Eag1弱陽性表達,5例為Eag1強陽性表達,陽性表達率為90%,強陽性表達率為50%。在10例Ⅲ期的宮頸癌組織中,Eag1的表達情況與其在Ⅱ期宮頸癌組織一樣。15例Ⅳ期的宮頸癌組織中,Eag1均為陽性表達,其中3例為Eag1弱陽性表達,12例為強陽性表達,因此陽性表達率為100%,強陽性表達率為80%。Eag1在不同分期的宮頸癌組織中的陽性表達率無明顯差異,但表達強度差異明顯,具有統計學意義(P=0.011，見表1)。

圖1 不同分級宮頸上皮內瘤變組織Eag1表達 (SP法,×100)Figure 1 Eag1 expression in cervical intraepithelial neoplasia tissues (SP,×100)

圖2 不同分期宮頸鱗癌組織Eag1表達 (SP法,×100)Figure 2 Eag1 expression in cervical carcinoma tissues (SP,×100)

表1不同臨床分期中Eag1的表達情況

Table1ExpressionofEag1incervicalcarcinomatissues

臨床分期強陽性弱陽性陰性合計Ⅰ期44210Ⅱ期54110Ⅲ期54110Ⅳ期123015合計2615445

3 討論

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,尤其在發展中國家的患病率更高。近年來隨著社會的開放,過早性生活和性生活紊亂等原因,其發病率呈明顯上升且年輕化趨勢。宮頸癌起病較為隱匿,早期無明顯特異性臨床癥狀,故大多數患者會缺乏重視,因此在發現病情時已是臨床中晚期。因此,我們急需尋找可以早期診斷并提示患者預后的生物學標志。

在細胞膜表面的眾多離子通道中,鉀離子通道的分布最廣泛、家族規模最龐大[3]。細胞許多重要的生理病理過程,如細胞膜電位的形成、激素分泌、興奮性、基因表達、細胞增殖和凋亡與鉀離子通道密切相關。最近的研究發現,多種鉀離子通道的亞族除了在細胞正常的生理活動中發揮重要作用,也參與了多種腫瘤細胞的增殖、周期、凋亡和侵襲等過程[4]。其中,Eag1是最受關注的一種亞族。Eag1最早發現于果蠅體內,它是電壓門控型鉀離子通道的成員之一,由EAG(ether à go-go)基因編碼。進一步的研究發現,在正常人體組織中,Eag1在腦組織中高度表達,在胎盤中少量表達,并在肌細胞中短暫表達。但是Eag1在多種人類腫瘤細胞和組織中高度表達,且參與了腫瘤細胞增殖、細胞周期等過程[5,6]。之后的研究證實:Eag1可能受miR-296-3p[7]、miR-155[8]、miR-34a[9]等的調控。此外,它還有助于惡性細胞的生長和癌前病變的惡性轉化[10]。進一步的研究表明,Eag1的表達水平與腫瘤大小、轉移、分期、浸潤深度等有關,可提示惡性腫瘤患者的臨床預后[11]。因此,Eag1已成為一個明確的癌基因,但其在宮頸癌中的作用和可能的機制尚不明確。

本研究中,Eag1在宮頸癌組織的表達陽性率明顯高于正常宮頸組織和宮頸上皮內瘤變組織,提示Eag1可能與宮頸癌的發生有一定的關聯。而在45例宮頸癌組織標本中,Eag1陽性表達率高于80%,且大部分為強表達。進一步研究表明:臨床分期越高,Eag1的表達強度越高,提示Eag1與宮頸癌患者的預后有關。

綜上所述,在臨床病理分期較高的病例中,Eag1的高陽性表達率證實了Eag1可能參與了宮頸癌發展的過程,而且宮頸癌患者Eag1表達水平與臨床預后有顯著相關性。檢測宮頸病變中的Eag1蛋白可作為判斷患者是否存在潛在的惡性危險的依據。但上述研究仍存在不足,在接下來的研究中我們將檢測Eag1在宮頸癌細胞中的表達和作用并繪制不同病理分期宮頸癌患者的生存曲線以進一步證實上述結論。