炎癥性腸病中MT、NF-κB及HIF-1α表達(dá)的相關(guān)性

高 闖，張目涵，王斌斌，杜曉博，王丹丹，楊貝貝，耿 麗，王許平，馮百歲

(鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科暨炎癥性腸病中心，吳階平醫(yī)學(xué)基金會炎癥性腸病聯(lián)盟河南省炎癥性腸病中心,鄭州 450014;*通訊作者,E-mail:fbs163@163.com)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)是一類多種病因引起、異常免疫反應(yīng)介導(dǎo)的腸道慢性復(fù)發(fā)性炎癥，包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(crohn’s disease，CD)。腸道黏膜屏障功能受損是炎癥性腸病的重要發(fā)病機(jī)制，當(dāng)腸道黏膜屏障受損后加重致病菌的感染，通過細(xì)菌氧耗增加、激活缺氧敏感通路等途徑造成腸道缺氧區(qū)域的形成[1]。金屬硫蛋白(metallothionein，MT)是一類富含半胱氨酸的低分子量蛋白質(zhì)，共有四種亞型，分別為MT-1、MT-2、MT-3和MT-4。其中主要亞型為MT-1和MT-2，廣泛分布于多種組織器官中[2]。MT-1/2作為體內(nèi)重要的抗氧化劑，因?yàn)樗慕Y(jié)構(gòu)域中含有大量處于還原狀態(tài)的巰基，是其發(fā)揮抗氧化作用的活性中心[3]，在腸道炎癥中MT可能通過參與抑制氧化損傷作用來發(fā)揮保護(hù)腸道屏障功能的作用。正常條件下核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)的表達(dá)受到抑制，當(dāng)組織發(fā)生缺氧及炎癥條件下可以促進(jìn)NF-κB的表達(dá)[4]。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)在組織中具有高度的氧敏感性，細(xì)胞正常氧濃度下HIF-1α可以發(fā)生降解，缺氧環(huán)境可以增加HIF-1α的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性且處于高表達(dá)狀態(tài)[5]。本文通過檢測MT、NF-κB及HIF-1α的表達(dá)水平及其相關(guān)性來探究它們在炎癥性腸病中的作用，從而為炎癥性腸病的治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017-06～2018-06鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院住院的炎癥性腸病患者結(jié)腸組織活檢石蠟包埋標(biāo)本及血清樣本，其中UC患者30例，年齡18-55歲，平均(35.4±6.6)歲；CD患者30例，年齡20-60歲，平均(38.2±7.8)歲。所有患者均符合2018年中華醫(yī)學(xué)會消化病學(xué)分會炎癥性腸病學(xué)組制定的UC及CD診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]。另外選取的30例結(jié)腸組織對照組均為結(jié)直腸癌患者外科手術(shù)切除距癌組織5 cm以上的結(jié)腸組織，年齡25-55歲，平均年齡(40.7±8.5)歲。30例健康志愿者血清標(biāo)本作為對照，年齡23-50歲，平均年齡(31.2±7.4)歲。所有對象受試前均未接受糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑等治療，未合并其他自身免疫性疾病。研究對象均簽署知情同意書。

1.2 常規(guī)免疫組織化學(xué)SABC法檢測

MT及NF-κB的表達(dá)IBD患者的活檢組織及結(jié)直腸癌患者的癌旁組織進(jìn)行石蠟包埋切片，組織切片經(jīng)脫蠟、水化、封閉、抗原微波修復(fù)、分別滴加兔抗人多克隆抗體MT(博奧森生物技術(shù)公司)及NF-κB p65(美國Affinity公司)(稀釋濃度分別是1 ∶400及1 ∶100)、滴加生物素標(biāo)記的二抗、過氧化物酶復(fù)合物、DAB顯色、蘇木素復(fù)染、各步驟之間用PBS沖洗3次，每次5 min，依次脫水、透明、封片。以PBS代替一抗作陰性對照，以已知陽性切片作陽性對照。均嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作。免疫組織化學(xué)染色在光鏡(400倍)下選取5個不重復(fù)視野觀察，胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕褐色顆粒的細(xì)胞為陽性細(xì)胞，取每個視野下平均陽性細(xì)胞作為計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)，陽性細(xì)胞所占百分比：0-25%為0分，26%-50%為1分，51%-75%為2分，≥75%為3分；染色強(qiáng)度：無色或黃色為1分，棕色為2分，褐色為3分，以上兩項(xiàng)得分之和≥3分為陽性，<3分為陰性。

1.3 ELISA法檢測血清中HIF-1α的質(zhì)量濃度

所有研究對象均在清晨空腹抽取3 ml靜脈血，離心后取血清凍存，應(yīng)用ELISA試劑盒檢測UC組、CD組及健康對照組血清中HIF-1α的質(zhì)量濃度，試劑購買自美國R&D公司，實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 炎癥性腸病患者結(jié)腸黏膜中MT、NF-κB的表達(dá)比較

正常對照組、UC組、CD組結(jié)腸黏膜組織中MT表達(dá)陽性率分別為80%(24/30),20%(6/30)和24%(7/30);NF-κB的表達(dá)陽性率分別為17%(5/30),90%(27/30)和87%(26/30)。各組結(jié)腸組織中MT和NF-κB表達(dá)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。其中MT的表達(dá)UC組和CD組低于正常對照組，NF-κB的表達(dá)UC組和CD組高于正常對照組。各組結(jié)腸組織中MT的表達(dá)見圖1，NF-κB的表達(dá)見圖2。

2.2 各組血清中HIF-1α的質(zhì)量濃度

CD組和UC組血清中HIF-1α的表達(dá)水平高于正常對照組(均P<0.05,見表1)。

A.正常對照組B.CD組C.UC組圖1 各組結(jié)腸組織中MT的表達(dá)Figure 1 Expression of MT in colon tissue of each group

A.正常對照組B.CD組C.UC組圖2 各組結(jié)腸組織中NF-κB的表達(dá)Figure 2 Expression of NF-κB in colon tissue of each group

表1各組血清中HIF-1α的表達(dá)水平(pg/ml)

Table1ExpressionlevelsofHIF-1αinserumofeachgroup(pg/ml)

組別nHIF-1αFP正常對照組3083.08±21.349.685<0.05CD組30234.72±62.32?UC組30209.56±54.18?

與正常對照組比較，*P<0.05

2.3 MT、NF-κB及HIF-1α之間表達(dá)的相關(guān)性分析

使用Pearson相關(guān)性分析檢測各組結(jié)腸組織中MT的表達(dá)與結(jié)腸組織中NF-κB的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.792，P<0.01)；各組結(jié)腸組織中MT的表達(dá)與血清中HIF-1α的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.746，P<0.01)；各組結(jié)腸組織中NF-κB的表達(dá)與血清中HIF-1α的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.814,P<0.01)。

3 討論

炎癥性腸病是一種病因和發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚的腸道慢性非特異性炎癥性疾病，其發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，涉及感染、免疫、遺傳、環(huán)境等因素[7]。研究發(fā)現(xiàn)在炎癥條件下造成結(jié)腸黏膜缺氧區(qū)域形成是炎癥性腸病重要的發(fā)病機(jī)制之一[8]。結(jié)腸炎癥反應(yīng)可以引起多種活性氧物質(zhì)，包括過氧化物、超氧化物、有機(jī)氧、單體氧等，這類活性氧主要在內(nèi)源性線粒體氧化呼吸鏈產(chǎn)生，腸道炎癥條件下促進(jìn)活性氧物質(zhì)大量表達(dá)，抑制線粒體氧化反應(yīng)，減少ATP的產(chǎn)生，影響結(jié)腸細(xì)胞能量供給，進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)[9]。

MT是由多種應(yīng)激條件下誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類應(yīng)激反應(yīng)蛋白，它的結(jié)構(gòu)中大量巰基結(jié)構(gòu)可以直接發(fā)揮抗氧化作用，同時研究表明MT可以直接參與氧化呼吸中三羧酸循環(huán)中ATP酶硝基化促進(jìn)葡萄糖利用及能量供給[10]，又可以通過抑制活性氧合成酶減少活性氧的產(chǎn)生來減輕炎癥損傷，所以MT可以通過多種機(jī)制發(fā)揮其高效細(xì)胞保護(hù)劑的作用[11]。

NF-κB是1986年在B淋巴細(xì)胞的細(xì)胞核提取物中發(fā)現(xiàn)的，正常條件下NF-κB與細(xì)胞內(nèi)源性抑制物IB(inhibitor of NF-κB，IB)結(jié)合呈非活性狀態(tài)[12]。研究證明NF-κB是一種多效的信號轉(zhuǎn)錄因子，受多種因素如趨化因子、氧化應(yīng)激等刺激而激活后可以參與機(jī)體多種炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等多種變化過程[13]。本研究結(jié)果顯示不同結(jié)腸黏膜中MT和NF-κB的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，同時MT與NF-κB的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.792，P<0.01)，研究發(fā)現(xiàn)MT可以通過抑制IB解離來抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性[14]，提示MT可能通過抑制NF-κB的激活在腸道的保護(hù)機(jī)制中發(fā)揮作用。

HIF-1α是一種隨細(xì)胞氧含量變化而產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄激活因子，正常細(xì)胞環(huán)境中HIF-1α處于不穩(wěn)定狀態(tài)，容易被氧依賴的泛素蛋白酶體所降解，缺氧環(huán)境中HIF-1α穩(wěn)定性增加并且在多種組織中大量表達(dá)[15]。HIF-1α可以促使多種基因表達(dá)通過增加缺氧組織供氧能力或增強(qiáng)缺氧細(xì)胞的缺氧耐受能力來代償性維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性[16]。研究表明NF-κB信號通路激活可以促進(jìn)HIF-1α的表達(dá)[17]。本研究結(jié)果顯示UC及CD患者血清中HIF-1α的表達(dá)高于正常對照組(P<0.05)。各組結(jié)腸黏膜中NF-κB的表達(dá)與血清中HIF-1α的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.814,P<0.01)。

綜上所述，MT表達(dá)變化可能影響NF-κB及HIF-1α的表達(dá)參與炎癥性腸病的發(fā)病過程,因此進(jìn)一步了解MT的作用機(jī)制可以提供炎癥性腸病新的治療靶點(diǎn)。