痰液CNRIP1基因甲基化檢測對于肺癌診斷的意義

郭 琪,胡 嬌,宋永春,張 毅,胡明軍*

(1西安市胸科醫院外科,西安 710000;2西安交通大學第一附屬醫院腫瘤外科;*通訊作者,E-mail:769015264@qq.com)

肺癌是目前威脅人類健康最常見的惡性腫瘤,其發病率在所有惡性腫瘤居于首位[1]。目前對于肺癌的治療,專家共識仍是以手術為主的綜合性治療,并且目前的治療技術已經有了很大的進展,但是,仍有較多的患者(約75%-82.5%)在臨床診斷時就已經處于中晚期,其5年生存率低于20%,這與肺癌早期診斷及早期治療困難有關[2]。所以,發現一種經濟、靈敏、準確度高的肺癌診斷方法,對于疾病的治療、預后均具有十分重大的意義。

目前研究發現,基因甲基化改變與惡性腫瘤的發生具有密切的關系,且相關基因甲基化檢測對于胃癌、乳腺癌及肺癌等惡性腫瘤的診斷及鑒別診斷具有一定的指導意義。既往研究發現[3,4],大麻素受體相互作用蛋白-1(cannabinoid receptor interacting protein 1,CNRIP1)基因在胃癌、結直腸癌、前列腺癌患者中呈現高甲基化狀態,但是,尚無研究探討CNRIP1基因甲基化改變與肺癌的關系。所以,本研究旨在通過研究肺癌組織及對應的患者痰液中該基因的甲基化發生率,并與正常組織及健康人群對照分析,研究該基因甲基化改變與肺癌的相關性,分析探討甲基化改變與肺癌的病理分型、病期、性別等的相關性。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2016-01～2017-06就診于西安市胸科醫院和西安交通大學第一附屬醫院并行手術治療的肺癌患者80例,所有患者術后病例均提示惡性腫瘤,并于手術前3 d指導患者留取晨起深部痰液,置于Saccomanno固定液中。所有腫瘤組織及癌旁組織(距癌組織邊緣大于5 cm)均于離體后30 min內取材于液氮中凍存。選取西安交通大學第一附屬醫院體檢中心就診的健康人員的痰液標本30例作為對照,所選健康人員按年齡分層隨機選取,并且無肺部疾病,所有痰液均為晨起深部痰液。所有研究對象均簽署知情同意書,并報醫院倫理委員會批準。為控制誤差及偏倚,所有標本收集、保存的人員不參與具體實驗。

1.2 主要試劑

組織及血漿DNA提取試劑、甲基化修飾試劑盒、PCR試劑等均購買自天根生化科技(北京)有限公司。PCR引物由華大基因(BGI)合成。

1.3 甲基化特異性PCR法檢測痰液及組織DNA甲基化狀態

甲基化特異性PCR方法(MSP法)的原理:DNA啟動子區的胞嘧啶(C)在亞硫酸鹽修飾后則變為尿嘧啶(U),而發生甲基化的胞嘧啶(C)則在亞硫酸鹽修飾后不變;以亞硫酸鹽修飾后的DNA作為PCR模板,分別以甲基化特異性引物和非甲基化特異性引物進行PCR擴增,根據結果判定目標基因的甲基化狀態。具體分析如下:①該樣本DNA只以甲基化特異性引物進行PCR后獲得條帶,判定為該樣本中此基因發生了甲基化改變;②而樣品DNA以甲基化特異性引物和非甲基化特異性引物分別進行PCR后均獲得條帶,也判定為該樣本此基因發生了甲基化改變;③當該樣本DNA僅以非甲基化特異性引物進行PCR后均獲得條帶的,判斷該樣本此基因未發生甲基化改變。

1.3.1 DNA提取 嚴格按照說明書采用天根生化科技有限公司的基因組提取試劑盒對組織標本和痰液標本進行基因組DNA提取。提取結果均采用紫外線分光光度計測定純度和含量。

1.3.2 亞硫酸鹽修飾 按照說明書采用EpiTect BisulfiteKit試劑盒對所提取的DNA進行基因甲基化修飾。

1.3.3 MSP法檢測 CNRIP1基因啟動子區甲基化程度具體引物及退火溫度[5](見表1)。

表1CNRIP1基因MSP引物及退火溫度

Table1PrimersofCNRIP1MSPandannealingtemperature

引物名稱 引物序列(5′-3′)產物大小(bp)退火溫度(℃)CNRIP1 MSP-M正向:TCGTTTTTTGGTATAGTGGTC174 52反向:CAAATCCGCGCAACTAAACNRIP1 MSP-U正向:GTTTTGTTTTTTGGTATAGTGGTT177 52反向:CAAATCCACACAACTAAAAAC

CNRIP1 MSP-M:CNRIP1基因甲基化特異性引物;CNRIP1 MSP-U:CNRIP1基因非甲基化特異性引物

PCR反應體系為25 μl,包括雙蒸水11.75 μl,模板3 μl,引物(正/反)各1 μl,dNTPs 2 μl,DNA buffer 6 μl,DNA聚合酶(HotStar Taq enzyme)0.25 μl。反應條件:95 ℃預熱30 s;94 ℃ 30 s,48 ℃ 30 s(退火),72 ℃ 30 s,共35個循環;72 ℃ 5 min。結果經2%瓊脂糖凝膠電泳及紫外顯像,結果根據上述原理中判讀標準進行判讀,記錄發生甲基化的組織或痰液標本例數。

1.3.4 統計分析 運用SPSS 13.0軟件對肺癌組織和癌旁組織標本之間CNRIP1基因甲基化發生率的差異、肺癌患者和健康對照痰液標本中CNRIP1基因甲基化發生率的差異以及根據性別、病理分型、病理分期、吸煙與否對肺癌患者進行分組,比較不同組別之間該基因甲基化發生率之間的差異,統計分析采用卡方檢驗進行檢測,以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 組織及痰液CNRIP1基因甲基化結果

根據甲基化結果判定標準判讀,80例肺癌組織中,68例中CNRIP1基因發生了甲基化改變,發生率為85%,而80例癌旁組織,僅7例中該基因發生了甲基化改變,發生率為8.75%,差異具有統計學意義(P<0.01);80例肺癌患者的痰液標本中,63例痰液CNRIP1基因發生了甲基化改變,其發生率為78.75%,而30例健康對照組的痰液中僅1例中檢測出甲基化改變,發生率僅為3.33%,差異具有統計學意義(P<0.01,見表2,圖1)。

表2組織及痰液標本CNRIP1基因甲基化發生比較(例)

Table2ComparisonofCNRIP1genemethylationbetweentissuesamplesandsputumsamples(cases)

標本類型nCN RIP1基因甲基化狀態陽性陰性χ2P組織標本93.4<0.01 癌組織806812 癌旁組織80773痰液標本51.0<0.01 肺癌患者806317 健康對照30129

M.以甲基化特異性引物進行PCR后條帶;U.以非甲基化特異性引物進行PCR后條帶圖1 組織及痰液CNRIP1基因甲基化結果Figure 1 Methylation results of CNRIP1 gene in tissues and sputum

結果顯示,肺癌患者的痰液與組織標本的甲基化發生率具有較高的一致性,其Kappa檢驗提示:Kappa值為0.791,大于0.75,具有較高的一致性(見表3)。所以,痰液基因甲基化可以反映癌組織的基因甲基化改變。

表3肺癌患者痰液與組織標本CNRIP1甲基化發生率一致性比較(例)

Table3ConsistencyofCNRIP1genemethylationintissuesandsputumoflungcancer(cases)

痰液標本組織標本陽性陰性Kappa陽性6300.791陰性512

2.2 痰液CNRIP1基因甲基化與肺癌患者臨床病理特征之間的相關性分析

根據患者的性別、吸煙狀況、病理分型、病理分期等進行分類,結果顯示痰液CNRIP1基因甲基化狀態與性別、吸煙狀況、病理分期等無相關性,但是,在45例鱗癌患者痰液標本中,41例發生了甲基化改變,其甲基化發生率為91.1%,其發生率較其他類型肺癌患者均明顯增高,差異具有統計學意義(P=0.009,見表4)。

表4痰液CNRIP1基因甲基化與肺癌患者臨床病理特征之間的相關性(例)

Table4RelationshipsbetweenCNRIP1genemethylationinsputumoflungcancerandclinicopathologicfeatures(cases)

指標nCNRIP1基因甲基化狀態陽性陰性χ2P性別0.060.80 男453510 女35287吸煙狀況0.150.70 是39309 否41338病理分型9.46a0.009 鱗癌454147.81b0.005 腺癌251690.05c0.83 小細胞肺癌10646.37d0.012病理分期0.420.93 TNM Ⅰ級1293 TNM Ⅱ級35287 TNM Ⅲ級30246 TNM Ⅳ級321

a病理分型三組比較;b腺癌組和鱗癌組比較;c腺癌組和小細胞肺癌組比較;d鱗癌組和小細胞肺癌組比較

3 討論

肺癌目前是威脅人類健康且發病率最高的惡性腫瘤,其發病率及死亡率均居于惡性腫瘤的首位。眾所周知,對于惡性腫瘤最重要的是早期診斷和早期治療,目前對于肺癌的診斷方法主要有CT、腫瘤標志物、穿刺活檢等[6-8]。但是,目前在中國,疾病發現時大多處于中晚期(約占75%-82.5%)[2],這與本研究中所發現的比例大致相同(本研究中處于I期的患者僅占15%,中晚期患者占85%)。所以,研究發現疾病的早期診斷方法對于疾病的治療就顯得至關重要。

目前研究認為,基因甲基化參與基因轉錄翻譯啟動的調節,從而參與到腫瘤的發生發展中來,既往研究發現,P16、APC、MGMT、ASC和DAPK等抑癌基因在胃癌、食管癌、肺癌等疾病中均發生甲基化改變,從而導致基因表達沉默[9,10]。

既往研究發現,外周血、糞便等組織基因甲基化對于腫瘤的早期診斷具有一定的意義,且標本易于采集、對患者無創且容易接受。Guo等[11]通過糞便檢測FBN1基因甲基化用于結直腸癌的檢測;黃大業等[12]通過血漿檢測MAL基因甲基化對于肺癌的檢測,但對于病理分型無意義;王長春等[13]通過外周血對于APC、RARβ2、CDH1、p16INK4α、RASSF1A抑癌基因的甲基化狀態進行檢測,并且分析基因甲基化狀態與食管癌的相關性。但對痰液基因分析的報道尚不多見,封杰等[14]對痰液、氣管灌洗液等標本中MPDZ基因甲基化進行分析,結果顯示:痰液標本中甲基化檢出率為55%,比本研究的檢出率略低,但也提示了痰液甲基化監測對于肺癌的意義。

既往研究[3,4]發現大麻素受體相互作用蛋白-1(cannabinoid receptor interacting protein 1,CNRIP1)基因甲基化對于結直腸癌具有明顯的相關性,說明該基因是一種潛在的抑癌基因。既往診斷肺癌的基因甲基化研究均提示對于病理分型無相關性,對于疾病的早期診斷有意義,但對于病理分型無意義,例如,封杰等[14]通過痰液檢測MPDZ基因甲基化對于肺癌的檢測,提示肺癌患者痰液MPDZ基因甲基化發生率為55%,對于疾病的診斷準確度和靈敏度分別為55%和100%[14]。本研究發現,痰液CNRIP1基因甲基化檢測對于肺癌的診斷準確度和靈敏度分別為78.75%和96.67%,這與既往研究的準確度和靈敏度大致相同。并且,本研究提示CNRIP1基因在肺鱗癌患者中甲基化發生率為91.1%,與其他類型的肺癌相比具有統計學意義,這提示CNRIP1基因甲基化對于鑒別肺癌的病理類型具有一定意義。

綜上所述,痰液CNRIP1基因甲基化檢測對于肺癌的早期診斷具有較高的敏感度和特異度,并且對于肺鱗癌的診斷具有更高的敏感度,對于肺癌的病理分型具有一定的理論指導意義。本研究從基本層面發現了CNRIP1基因甲基化改變與肺癌的相關性,這對于研究肺癌的發生發展以及基因靶點等提供了一定的線索,為后續研究作用機制等提供了一定的理論支持。