仿生磷酸鈣緩釋涂層改性三維支架的制備及性能研究

劉 寧,朱 勇,劉昌奎,郭 芳,黃 碩,李 芳

(1西安醫學院口腔醫學系口腔頜面外科學教研室,西安 710021;2軍事口腔醫學國家重點實驗室,國家口腔疾病臨床醫學研究中心,陜西省口腔醫學重點實驗室,空軍軍醫大學口腔醫院修復科;*通訊作者,E-mail:ningliu@xiyi.edu.cn)

隨著口腔種植學的飛速發展,口腔種植義齒已不再是傳統義齒修復的補充手段,而成為患者較為理想的義齒修復方式,被贊譽為人類的第三副牙齒。然而,由于牙齒拔除后牙槽嵴的吸收改建,常導致患者牙槽嵴寬度、高度不足,限制種植體的植入。自體骨移植是骨組織缺損修復的金標準,但由于口腔內種植區可利用的自體骨量有限,異位取骨又伴隨多種并發癥,因此多種骨替代材料被研制和開發出來[1]。去蛋白牛骨無機材料(deproteinized bovine bone,DBB)是目前口腔臨床廣泛應用的骨替代材料,具有較高的親水性、與人體骨組織相似的晶體結構,但其生物相容性一般、缺乏成骨誘導能力、不能促進多潛能間充質干細胞向成骨細胞方向分化,限制其成骨效果[2]。淫羊藿苷(icariin,ICA)是一種良好的骨性誘導因子,性質穩定,能夠促進骨髓間充質干細胞成骨分化[3]。堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)是間充質干細胞早期成骨分化的指標。本研究擬運用仿生磷酸鈣涂層技術,將ICA負載到DBB表面的磷酸鈣(calcium phosphate,CaP)涂層中,檢測脂肪干細胞(adipose derived mesenchymal stem cells,ASCs)在改性材料上的ALP活性,為改性材料用于臨床骨再生治療提供實驗室依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

健康雄性C57小鼠,2周齡,4只,向空軍軍醫大學動物實驗中心申領。

1.2 主要試劑和儀器

α-MEM培養基、胎牛血清、PBS緩沖液(Hyclone,美國),膠原酶Ⅰ型(Sigma,美國),淫羊藿苷(源葉生物,中國),成骨誘導分化培養基試劑盒、成脂誘導分化培養基試劑盒、茜素紅、油紅O染液(賽業,中國)。超凈工作臺、低溫高速離心機(Thermo,美國),二氧化碳恒溫培養箱(三洋,日本),倒置相差顯微鏡及照相系統(Nikon,日本),掃描電鏡(JEOL,日本),酶標儀(Tecan,瑞士)。

1.3 脂肪干細胞的分離、培養及形態學觀察

4只2周齡C57雄鼠過量麻醉處死,無菌條件下,取雙側腹股溝脂肪組織置于培養皿中,清除外包膜及肉眼可見的小血管,PBS清洗后剪碎成約為1 mm3組織塊,加入0.075%的膠原酶37 ℃振蕩消化60 min。待消化完成后,1 000 r/min離心5 min。棄上清,向離心管內加入2 ml含10%胎牛血清的α-MEM培養液,再次1 000 r/min離心5 min。加入5 ml培養液重懸,將懸液接種于25 cm2培養瓶內,置于37 ℃、5% CO2孵箱中培養。培養3 d后換液,顯微鏡下觀察細胞形態。細胞融合度達到80%時傳代,將細胞培養至第3代,進行后續實驗。

1.4 成骨誘導及成脂誘導

成骨誘導實驗取第3代ASCs,消化后以105個/孔的密度接種于包被0.1%明膠的6孔板中培養。當細胞達到60%-70%融合度時,向6孔板中加入2 ml脂肪間質干細胞成骨誘導分化培養液,每3 d換1次液。培養至21 d,4%多聚甲醛溶液固定30 min,PBS漂洗3遍,茜素紅染液常溫染色15 min,PBS漂洗3遍,將培養板置于顯微鏡下觀察成骨染色效果。

成脂誘導實驗取第3代ASCs,消化后以105個/孔的密度接種于6孔板中培養。當細胞達到100%融合時,小心地吸走培養液,向孔板中加入2 ml成脂誘導分化培養液。成脂誘導18 d,4%多聚甲醛溶液固定30 min,PBS漂洗3遍,油紅O染料工作液染色30 min,PBS漂洗3遍,將培養板置于顯微鏡下觀察成脂染色效果。

1.5 仿生礦化磷酸鈣涂層的制備及掃描電鏡觀察

將0.1 g DBB材料浸泡在10 ml 5倍模擬體液(simulated body flude,SBF)(684 mmol/L NaCl;21 mmol/L NaHCO3;5 mmol/L Na2HPO4·2H2O;7.5 mmol/L MgCl2·2H2O)中24 h,冷凍干燥,則在材料表面形成一層無定型CaP涂層。然后將其浸泡在1 ml飽和SBF(2 mmol/L Na2HPO4·2H2O;40 mmol/L HCl;4 mmol/L CaCl2·2H2O;50 mmol/L TRIS base)中48 h,冷凍干燥,則在無定型CaP涂層表面形成結晶狀CaP涂層[4]。將材料脫水、干燥、噴金,場發射掃描電子顯微鏡觀察材料表面形態。

1.6 細胞附著的掃描電鏡觀察

取生長狀態良好的第3代ASCs,0.25%胰蛋白酶消化1 min,1 000 r/min離心5 min,收集細胞,調整密度為106個/ml的細胞懸液。將0.1 ml上述細胞懸液均勻滴加于板底放有DBB或CaP涂層改性DBB的96孔板中。細胞接種于支架材料上24 h,吸棄原培養液,PBS小心漂洗3遍,2.5%戊二醛固定12 h。50%，70%，80%，90%，95%的乙醇脫水1次,100%乙醇脫水2次,每次15 min。臨界點干燥,噴金,掃描電鏡觀察細胞在材料上的附著、伸展情況。

1.7 堿性磷酸酶活性檢測

涂層制備時在飽和SBF溶液中加入5 mg/L的ICA,ICA會隨著結晶狀CaP涂層的形成沉積到CaP晶體中,從而制備負載ICA的CaP涂層改性DBB材料。將實驗分為3組:DBB組(未經處理的DBB);CaP組(CaP涂層改性的DBB);ICA-CaP組(CaP涂層內含有ICA的DBB)。將各組材料置于12孔板中,每孔放入0.2 g材料,用含10% FBS的α-MEM培養液潤濕材料。取生長狀態良好的第3代ASCs,消化、離心、重懸,血細胞計數器計數,將細胞密度調整為5×105個/ml的細胞懸液,12孔板每孔加入1 ml細胞懸液均勻接種,5% CO2孵育箱內孵育,每3-4 d換一次培養液。培養至第7天吸棄培養液,PBS漂洗3遍,每孔加入1 ml 1% Triton X-100,37 ℃孵育1 h,吸出裂解液,離心后取上清。在96孔板中,按照堿性磷酸酶測定試劑盒和BCA蛋白含量檢測試劑盒說明書要求進行檢測。根據公式計算堿性磷酸酶活性:堿性磷酸酶(U/g)=(測定孔吸光度-空白孔吸光度)/(標準孔吸光度-空白孔吸光度)×酚標準品濃度(0.02 mg/ml)÷待測樣品蛋白濃度(g/ml)。

1.8 統計學分析

使用SPSS18.0軟件進行統計學分析,計量數據以均數±標準差表示,實驗結果采用one-way ANOVA進行統計分析,并采用最小顯著差法(least significant difference,LSD)進行組間比較,以雙側P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 脂肪干細胞形態學觀察

原代細胞培養3 d,顯微鏡下ASCs呈簇或散在分布,大部分細胞呈纖維細胞樣梭形,突起細長,部分細胞呈多邊形(見圖1)。

圖1 顯微鏡下觀察ASCs的細胞形態 (×100)Figure 1 The morphology of ASCs under a microscope (×100)

2.2 成骨誘導及成脂誘導

ASCs成骨誘導21 d,茜素紅染色,顯微鏡下觀察可見大量散在分布的紅色礦化結節,外圍呈橘紅色,中心呈紅棕色(見圖2A)。ASCs成脂誘導18 d,油紅O染色,顯微鏡下觀察可見細胞胞質內含有大量大小不等的橘紅色圓形脂滴(見圖2B)。

2.3 材料表面形貌及細胞附著的掃描電鏡觀察

DBB的表面為不平坦的溝壑狀形貌(見圖3A、3B)。CaP涂層改性DBB的表面為相互交錯的網格狀結晶體(見圖3D、3E)。ASCs接種在支架材料上24 h后的細胞形態,DBB和CaP涂層表面附著的細胞均鋪展良好,細胞形態完整呈扁平多角形,伸出偽足,但CaP涂層表面附著的細胞量相對較多,彼此連接呈片狀(見圖3C、3F)。

A.茜素紅染色(×100) B.油紅O染色(×200)圖2 ASCs成骨和成脂誘導染色Figure 2 Staining of ASCs osteogenesis and lipogenic induction

2.4 堿性磷酸酶活性檢測

ASCs在支架材料上培養7 d后的ALP活性結果(見圖4)。DBB組與CaP組的ALP活性差異無統計學意義。ICA-CaP組的ALP活性顯著高于DBB組和CaP組(P<0.05)。

3 討論

DBB是目前口腔臨床骨再生手術中廣泛應用的骨替代材料[5-7]。它是將小牛松質骨經多次煅燒和化學處理,徹底去除其中的有機成分,從而保留下來的基本骨小梁結構,是一種天然的具有骨引導性能的多孔支架材料。DBB的主要成分是羥基磷灰石,化學組成及晶體結構與人體松質骨接近。其具有較高的親水性,三維立體的多孔結構,可引導細胞向其內部生長和營養物質的進入。然而,DBB自身缺乏成骨誘導性能,不能誘導間充質干細胞向成骨細胞分化[7]。為了克服這個缺點,本研究擬運用仿生磷酸鈣涂層技術,將ICA負載到DBB表面,從而提高DBB促進骨再生的能力。

A.低倍鏡下DBB表面形貌 (×100); B.高倍鏡下DBB表面形貌 (×5 000); C.ASCs在DBB表面附著24 h后細胞形態 (×500);D.低倍鏡下CaP涂層表面形貌 (×100);E.高倍鏡下CaP涂層表面形貌 (×5 000);F.ASCs在CaP涂層表面附著24 h后細胞形態 (×500)圖3 材料表面形貌及細胞附著的掃描電鏡觀察Figure 3 Observation of surface morphology and cell attachment of scaffolds under scanning electron microscopy

與其他兩組比較,*P<0.05圖4 ASCs在支架材料上培養7 d后的ALP活性Figure 4 The ALP activity of ASCs cultured on the scaffolds for 7 d

ASCs是近年研究發現的一種新的成體干細胞,該細胞取材方便,增殖能力強,具有一定的免疫調節能力和多向分化潛能。De Ugarte等[8]的研究顯示,人脂肪來源間充質干細胞與骨髓來源間充質干細胞的成骨分化能力沒有明顯區別。近年來,人們逐漸認識到ASCs與三維支架材料聯合應用,可方便臨床上ASCs的移植操作,并且可有效促進組織再生[9,10]。因此,本研究選擇ASCs作為研究誘導成骨分化的種子細胞。然而細胞的原代培養是細胞學實驗研究的基礎,實驗首先采用膠原酶消化和密度梯度離心法對細胞進行分離培養,鏡下觀察細胞呈纖維細胞樣梭形。多向分化潛能是干細胞的重要生物學特性之一,成骨和成脂分化是干細胞的兩個基本分化方向,是目前公認的用于鑒定干細胞分化功能的方法。實驗分別將ASCs進行成骨和成脂誘導,誘導一段時間后可見細胞間出現大量的礦化結節和脂滴,表明細胞具備多向分化潛能,為本研究改性材料生物相容性和成骨誘導性能的檢測提供所需要間充質干細胞。

在眾多的涂覆方式中,仿生磷酸鈣涂層技術是一種簡便、高效的涂覆方法。不同于高溫等離子噴涂,仿生磷酸鈣涂層在生理溫度和pH條件下就會發生沉積,形成的晶體結構與骨質結構類似[11],且隨著CaP涂層晶體的形成,成骨誘導因子通過共沉積會結合到涂層的網絡結晶中并保持活性,從而賦予材料成骨誘導性能[12]。本研究采用仿生磷酸鈣涂層技術對DBB表面進行改性。掃描電鏡實驗結果表明,CaP涂層成功實現在DBB表面沉積,DBB表面原本是不平坦的溝壑狀形貌,CaP涂層沉積后變成相互交錯的網格狀結晶體,CaP涂層增大了DBB的孔隙和表面積。ASCs附著實驗的掃描電鏡結果顯示,CaP涂層表面附著的細胞數量相對較多,說明相比未經處理的DBB,ASCs在CaP涂層改性的DBB表面更容易附著。

ICA是從淫羊藿中提取的一種黃酮類化合物,是淫羊藿的主要活性成分之一,分子式為C33H40O15,分子量為676.65,價格低廉,性質穩定,常用于治療骨折及與骨代謝相關的疾病[13]。目前淫羊藿苷對骨髓間充質干細胞的成骨作用研究較多,體外和體內實驗證實ICA能夠促進骨髓間充質干細胞成骨分化,是一種良好的骨性誘導因子[14-16]。近年研究表明,淫羊藿苷亦可促進脂肪、牙周膜等組織來源的間充質干細胞成骨分化,但是此類研究相對較少。在ICA作用于ASCs的成骨分化研究上,僅檢索到寧兆榮等[17]通過兔下頜骨缺損再生的體內研究,證實ASCs復合負載淫羊藿苷的支架材料具有明顯的促進骨缺損修復能力,效果優于其他組。ALP是間充質干細胞早期成骨分化的指標,本研究將ASCs接種在ICA-CaP涂層改性的DBB表面并培養7 d,隨后檢測ALP活性,結果顯示ICA-CaP組的ALP活性顯著高于其他組(P<0.05),表明ICA可以有效促進ASCs的成骨分化,從而證明ICA-CaP涂層改性的DBB具有成骨誘導性能。然而,淫羊藿苷在材料上的最佳負載量以及改性DBB在體內促進骨再生的作用如何,課題組將在本實驗的基礎上做進一步研究。

本研究運用仿生磷酸鈣涂層技術對DBB進行改性,將ICA負載到DBB表面的磷酸鈣涂層中,檢測ASCs在材料上的附著及成骨分化,結果表明改性DBB具有良好的生物相容性及骨誘導性,有望為口腔臨床骨再生手術提供理想的骨替代材料。