miR-128通過調控NOVA1的表達抑制腎透明細胞癌發展的進程

徐 冰,毛曉娟,付曉亮,舒 濤,楊增悅,王 東*,郭金剛

(1陜西航天醫院泌尿外科,西安 710025;2渭南市婦幼保健院;3空軍醫科大學唐都醫院泌尿外科;*通訊作者,E-mail:wangdongtangdu@163.com)

腎透明細胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)屬于泌尿系統腫瘤,在所有腎癌中發病率最高,且在泌尿系統中發病率僅次于膀胱癌[1-3]。在世界范圍內,ccRCC的發病率及死亡率都呈現快速上升趨勢,嚴重影響人類的身體健康和生活質量[4]。目前ccRCC最有效的治療方法為根治性腎癌切除手術。約60%的腎透明細胞癌患者會發生病灶轉移,發生病灶轉移的患者在接受上述方式治療后仍有約30%的患者發生復發病灶轉移現象,并且發生病灶轉移的患者生存率非常低[5]。目前關于ccRCC的發生發展機制研究非常少,深入探索ccRCC的分子機制可以為其治療或診斷提供重要的理論基礎。

近年來,越來越多的研究顯示,微小RNAs(microRNAs,miRNAs)可通過調控功能基因轉錄后的表達水平,參與調控多種細胞生命過程,其中包括細胞的新陳代謝、增殖、分化以及凋亡等,并且在多種腫瘤發生發展過程中,miRNAs發揮重要的調控作用[6,7]。本研究表明:miR-218可通過調控NOVA1的表達抑制腎透明細胞癌發展的進程,這為了解ccRCC的發病機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞株與主要試劑

HK-2、Caki-1和Caki-2細胞系購于上海繼和生物科技有限公司,NOVA1、GAPDH、U6、miR-128等引物由生工生物工程(上海)有限公司合成;KSFM培養基購于上海博升生物科技有限公司;McCoy’s 5A培養基購于生工生物工程(上海)有限公司;胎牛血清、Trizol和Lipofectamine2000脂質體購自美國Invitrogen公司;mRNA、miRNA反轉錄試劑盒和Power SYBR Green PCR Master Mix均購于美國Gibco公司;Matrigel膠購于美國BD公司;NOVA1、GAPDH抗體和辣根過氧化物酶標記二抗均購于美國Santa公司;DharmaFECT Duo試劑、RIPA裂解液、ECL試劑均購于上海寶賽生物科技有限公司。

1.2 細胞培養

本研究以正常人腎上皮細胞HK-2細胞系和腎透明細胞系Caki-1、Caki-2等作為研究模型,利用KSFM培養基培養HK-2細胞,利用McCoy’s 5A培養基培養Caki-1和Caki-2細胞,培養基中均含有10%胎牛血清以及濃度為100 μmol/ml鏈霉素/青霉素。將加入培養基的細胞轉移至37 ℃ 5% CO2培養箱中繼續培養48 h,挑選生長狀態優良的細胞進行后續實驗。

1.3 細胞轉染

NC miRNA、miR-128 mimic、miR-128 inhibitor、siNOVA1均于上海吉瑪制藥技術有限公司購買,利用Lipofectamine2000脂質體與上述合成的核酸片段混合,按使用說明書轉染Caki-1或Caki-2細胞系,轉染后于培養箱中以正常細胞培養方式繼續培養24 h,利用RT-qPCR檢測分析細胞轉染效率。

1.4 細胞總RNA提取及實時熒光定量PCR

利用消毒無菌離心管收集培養的細胞,離心棄去上清,吸取1 ml Trizol試劑加入至離心管中,振蕩器上劇烈震蕩1 min;震蕩結束后向離心管中加入200 μl預冷氯仿再次震蕩,冰上靜置5 min;4 ℃ 13 000 r/min離心10 min;將上清液轉移至新的無菌無RNA酶污染的離心管中,加入1/2上清液體積的預冷異丙醇,上下顛倒混勻,-20 ℃靜置10 min;再次于低溫高速離心機中以同樣轉速離心10 min,棄去上清;加入預冷的75%乙醇,離心機中離心1 min棄去上清,重復1次;吸除并吹干乙醇,利用30 μl RNase free水溶解并混勻;超微量分光光度計檢測細胞總RNA OD260/280以及核酸濃度,進行后續實驗或-20 ℃保存備用。

利用M-MLV和TaqMan microRNA反轉錄試劑盒分別合成mRNA和miRNA,操作步驟參考試劑盒說明書,細胞總RNA用量為1 μg;隨后利用Power SYBR Green PCR Master Mix試劑盒進行mRNA或miRNA相對表達量檢測。檢測程序設定為:95 ℃,10 s;55 ℃,15 s;72 ℃,30 s;45個循環。mRNA內參為GAPDH,miRNA內參為U6。

1.5 細胞增殖(MTT)實驗

首先按照1.2細胞培養方法培養待檢測細胞系,利用胰蛋白酶酶解為單細胞,并充分懸浮,將細胞懸液接種于96孔板中,繼續培養48 h,將培養的細胞置于全自動熒光酶標儀中,以波長490 nm檢測細胞懸液的吸光值。

1.6 細胞侵襲實驗

將細胞培養所用試劑以及ThinCert細胞培養器均置于37 ℃條件下溫浴;以正常細胞培養方法培養細胞至對數生長期,胰蛋白酶消化細胞,消化結束以PBS及無血清培養基分別洗滌1次,并用無血清培養基懸浮,使細胞懸液濃度約為2×105個/ml;于下室(24孔板底部)中加入700 μl含有10%胎牛血清的細胞培養基,上室中加入100 μl待檢測細胞懸浮液,置于培養箱中培養24 h,擦除上室未發生侵襲的細胞,將發生侵襲的細胞利用1%結晶紫試劑染色,于倒置顯微鏡下記錄實驗結果并統計分析。

1.7 細胞凋亡檢測

利用干凈無菌10 ml離心管收集待檢測細胞,每種細胞的數目約為(1-5)×106個/ml,于離心機中以600 r/min離心5 min,將培養液棄除;將收集的細胞利用孵育緩沖液洗滌1次,再次600 r/min離心5 min,棄除洗滌液;加入0.1 ml標記試劑并重懸細胞,室溫避光孵育15 min,于離心機中600 r/min離心5 min,棄上清并用孵育緩沖液洗滌1次,加入Annexin/PI雙染熒光試劑,置于4 ℃避光孵育20 min,每隔4 min震蕩1次;利用流式細胞儀檢測細胞凋亡,激發波長為488 nm,FITC熒光檢測波長為515 nm,PI熒光檢測波長大于560 nm,記錄并統計檢測結果。

1.8 結合位點預測

利用microRNA.org-Targets and Expression(http://34.236.212.39/microrna/microrna/getGeneForm.do)和Target Scan Human 7.1(http://www.targetscan.org/vert-71/)預測分析miR-128的靶向調控基因,并利用上述分析數據庫預測miR-128與靶基因的結合位點。

1.9 雙熒光素酶報告載體構建及活性檢測

雙熒光素酶報告載體為pmirGLO載體,將NOVA1與miR-128預測的3′-UTR靶點序列(NOVA1 WT 3′-UTR)或突變序列的3′-UTR(NOVA1 MT 3′-UTR)構建于上述載體。NOVA1 3′-UTR突變序列以正常序列為模板,對結合位點區域進行點突變。將構建的不同載體分別與NC miRNA、miR-128 mimic或miR-128 inhibitor共轉染待檢測細胞,轉染試劑為DharmFECT Duo,以正常細胞培養條件培養48 h。培養結束后利用Dual-Glo luciferase系統檢測細胞熒光素酶活性并記錄實驗結果。

1.10 蛋白質提取定量及Western blot檢測

以方法1.2培養Caki-1或Caki-2細胞,培養結束收集細胞,利用RIPA裂解細胞,加入裂解液后混合均勻并置于冰上孵育20 min;隨后于低溫高速離心機中13 000 r/min離心20 min,取上清繼續實驗;利用BCA方法檢測細胞總蛋白濃度。將待檢測蛋白與加樣緩沖液充分混勻并于100 ℃變性,利用SDS-PAGE分離目的蛋白;電泳結束后于轉膜緩沖液中將目的蛋白電泳轉移至PVDF膜上;將含目的蛋白的PVDF膜置于含5%脫脂奶粉的封閉液中,室溫中處理1 h;將一抗NOVA1抗體稀釋500倍后孵育含目的蛋白的PVDF膜,4 ℃條件中孵育過夜;棄去或收集一抗,TBST緩沖液洗滌3次;室溫條件下,以終濃度為稀釋5 000倍的IgG標記羊抗兔二抗孵育1 h;棄去二抗,TBST緩沖液洗滌3次,洗滌結束后加入ECL顯影液,顯影系統中顯影拍照并記錄實驗數據,GAPDH作為內參。

1.11 統計學分析

本文所有統計數據均以平均值±標準差表示。數據結果統計軟件為SPSS19.0。利用單因素方差分析(ANOVA)和Student’st檢驗統計并分析數據間差異。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 腎臟正常上皮細胞與ccRCC細胞中miR-128的表達差異

在多種腫瘤細胞中,miR-128表達異常,并參與腫瘤的發生發展過程,為了研究miR-128在ccRCC發生發展過程中的生物學功能,首先分析miR-128在ccRCC細胞系中的表達變化。結果顯示,與腎臟正常上皮細胞HK-2組相比,miR-128在Caki-1和Caki-2細胞系中的表達水平顯著下降(P<0.05,見圖1)。

與HK-2細胞相比,*P<0.05圖1 miR-128在ccRCC細胞中的相對表達Figure 1 Relative expression of miR-128 in ccRCC cells

2.2 miR-128對ccRCC細胞增殖和侵襲的影響

根據上述結果可知,miR-128在ccRCC細胞中表達異常,為了深入研究miR-128對ccRCC發生發展的影響,本研究將miRNA-NC、miR-128 mimic或miR-128 inhibitor分別轉染Caki-1和Caki-2細胞,了解miR-128對ccRCC細胞增殖及侵襲的影響。首先利用RT-qPCR檢測細胞轉染后miR-128的表達水平,結果顯示,與miRNA-NC轉染組相比,miR-128 mimic轉染組Caki-1和Caki-2細胞中miR-128相對表達水平都顯著上調(P<0.01),miR-128 inhibitor轉染組相對表達水平都顯著下調(P<0.05,見圖2A)。再利用MTT檢測miR-128表達水平變化對細胞增殖的影響,結果顯示,與miRNA-NC轉染組相比,miR-128 mimic轉染組Caki-1和Caki-2細胞增殖率都顯著下降(P<0.05),miR-128 inhibitor轉染組細胞增殖率都顯著上升(P<0.01,見圖2B)。利用Transwell實驗檢測miR-128表達水平變化對細胞侵襲的影響,結果顯示,與miRNA-NC轉染組相比,miR-128 mimic轉染組每個視野中Caki-1和Caki-2細胞侵襲數量都顯著下降(P<0.05),miR-128 inhibitor轉染組細胞侵襲數量都顯著上升(P<0.05,見圖3)。

與miRNA-NC組相比,*P<0.05,**P<0.01圖2 miR-128抑制ccRCC細胞增殖Figure 2 The miR-128 inhibited the proliferation of ccRCC cells

2.3 miR-128對ccRCC細胞凋亡的影響

在癌癥發生發展過程中,細胞凋亡的變化也是一個非常重要的研究指標,當細胞正常凋亡發生紊亂時可引起細胞惡性增殖,促進癌癥進程,因此本研究分析了miR-128對ccRCC細胞凋亡的影響。結果顯示,與miRNA-NC轉染組相比,miR-128 mimic轉染組Caki-1和Caki-2細胞凋亡率都顯著升高(P<0.01),miR-128 inhibitor轉染組細胞凋亡率都顯著下降(P<0.05,見圖4)。

2.4 miR-128靶向調控NOVA1

在細胞中,miRNAs主要通過調控功能基因的表達水平影響細胞的生命過程,miRNAs為單鏈核苷酸并且一般不能編碼蛋白,成熟的miRNAs一般與靶向調控基因的3′-末端非編碼(UTR)區含有6-8互補核苷酸序列。因此本研究利用生物信息學預測分析成熟miR-128的潛在靶向調控基因及其調控結合位點,結果顯示,在NOVA1 mRNA的3′-UTR區域含有6個連續核苷酸序列與成熟miR-128互補(見圖5)。因此本研究構建了NOVA1基因3′-UTR野生型(WT-UTR)和3′-UTR突變(MT-UTR)熒光素酶報告載體,驗證上述序列是否為miR-128的直接靶向調控位點,結果顯示,在NOVA1 WT-UTR熒光素酶報告載體轉染的細胞中,與miRNA-NC轉染組相比,miR-128 mimic轉染組細胞熒光素酶活性明顯下降(P<0.05),而miR-128 inhibitor轉染組細胞熒光素酶活性上升(P<0.05,見圖6)。在NOVA1 MT-UTR熒光素酶報告載體轉染的細胞中,與NC轉染組相比,miR-128 mimic轉染組細胞熒光素酶活性無顯著性差異(P>0.05),miR-128 inhibitor轉染組細胞熒光素酶活性也無顯著性差異(P>0.05)。

與miRNA-NC組相比,*P<0.05圖6 miR-128抑制NOVA1活性Figure 6 The miR-128 inhibited the activity of NOVA1

2.5 miR-128對NOVA1表達的影響

根據2.3研究結果得出,NOVA1可能受miR-128的靶向表達調控,本研究利用RT-qPCR和Western blot驗證上述研究結果。利用miRNA-NC、miR-128 mimic或miR-128 inhibitor分別轉染Caki-1或Caki-2細胞,并檢測兩細胞系中NOVA1表達變化,結果顯示,與miRNA-NC轉染組相比,miR-128 mimic轉染組細胞中NOVA1的mRNA(見圖7)和蛋白表達水平(見圖8)都顯著下降(P<0.05),而miR-128 inhibitor轉染組細胞中NOVA1的mRNA(見圖7)和蛋白表達水平(見圖8)都顯著上升(P<0.01)。

與miRNA-NC組相比,*P<0.05,**P<0.01圖7 miR-128抑制NOVA1 mRNA的表達Figure 7 The miR-128 inhibited the mRNA expression of NOVA1

1.miRNA-NC;2.miR-128 mimic;3.miR-128 inhibitor;與miRNA-NC組相比,*P<0.05,**P<0.01圖8 miR-128抑制NOVA1蛋白表達Figure 8 The miR-128 inhibited the protein expression of NOVA1

2.6 NOVA1對ccRCC細胞增殖和侵襲的影響

因miRNAs常通過調控功能基因的表達影響細胞的生命過程,上述的研究顯示,NOVA1受miR-128表達調控,為了研究miR-128調控NOVA1對腎透明細胞癌的影響,隨后研究了NOVA1對細胞增殖和侵襲的影響。采用pc-DNA3.1空載體(control)、pc-DNA3.1/NOVA1(NOVA1)、control siRNA或siNOVA1分別轉染Caki-1和Caki-2細胞。首先檢測NOVA1的表達水平,結果顯示,與control轉染組相比,pc-DNA3.1/NOVA1轉染組Caki-1和Caki-2細胞中NOVA1表達水平都顯著上升(P<0.01);與control siRNA轉染組相比,siNOVA1轉染組,Caki-1和Caki-2細胞中NOVA1表達水平都顯著下降(P<0.05，見圖9)。利用MTT實驗檢測NOVA1對細胞增殖的影響,結果顯示,與control轉染組相比,pc-DNA3.1/NOVA1轉染組Caki-1和Caki-2細胞增殖率都顯著上升(P<0.05);與control siRNA轉染組相比,siNOVA1轉染組Caki-1和Caki-2細胞增殖率都顯著下降(P<0.05，見圖10A)。利用Transwell實驗檢測NOVA1對細胞侵襲的影響,結果顯示,與control轉染組相比,pc-DNA3.1/NOVA1轉染組Caki-1和Caki-2細胞侵襲能力都顯著上升(P<0.05);與control siRNA轉染組相比,siNOVA1轉染Caki-1和Caki-2組細胞侵襲能力都顯著下降(P<0.05,見圖10B、C)。

1.control;2.NOVA1;3.control siRNA;4.siNOVA1;與control組相比,**P<0.02;與control siRNA組相比,#P<0.05圖9 NOVA1在ccRCC細胞中的表達Figure 9 The expression of NOVA1 in ccRCC cells

與control組相比,*P<0.05,**P<0.01;與control siRNA組相比,#P<0.05,##P<0.01圖10 NOVA1調控ccRCC細胞增殖及侵襲Figure 10 NOVA1 regulated the proliferation and invasion of ccRCC cells

2.7 NOVA1對ccRCC細胞凋亡的影響

隨后研究分析了NOVA1在ccRCC細胞凋亡過程中的作用,結果顯示,與control轉染組相比,pc-DNA3.1/NOVA1轉染組NOVA1過表達時,Caki-1和Caki-2細胞系的凋亡率都顯著下降(P<0.05);與control siRNA轉染組相比,siNOVA1轉染組NOVA1表達沉默時,Caki-1和Caki-2細胞系的凋亡率都顯著上升(P<0.01,見圖11)。

與control組相比,*P<0.05;與control siRNA組相比,##P<0.01圖11 NOVA1調控ccRCC細胞凋亡Figure 11 NOVA1 regulated the apoptosis of ccRCC cells

3 討論

在人類細胞中,miRNAs的種類非常多,在miRNAs序列5′末端含有特殊的核苷酸序列,約含6-8個核苷酸,其可與靶向調控基因mRNA的3′末端非編碼區發生特異結合,對靶基因的表達進行調控。而miRNAs的合成過程可受某些功能基因的表達調控,并且在不同組織和細胞中,miRNAs序列高度保守,并且miRNAs表達具有組織特異性,成熟的miRNAs可調控與多種生命活動相關的信號途徑[8],同時可能參與包括腫瘤在內的多種疾病的調控,影響腫瘤的發生發展過程,主要包括腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡等[9-12]。近年來越來越多的研究顯示,不同的miRNAs可調控同一種腫瘤的發生發展,相同的miRNA可能調控不同腫瘤的進程[13]。例如在膀胱癌細胞中,miR-221、miR-223和miR-26等表達水平顯著上調[14];miR-345在結直腸癌[15]、肝癌[16]、乳腺癌[17]以及前列腺癌[18]等腫瘤細胞中表達異常,并調控上述腫瘤的發生發展。本研究顯示miR-128在ccRCC細胞中顯著下調,而目前尚未有miR-128影響ccRCC發生發展的報道。

目前已有研究顯示,miR-128在其他多種腫瘤發生發展過程中發揮重要調控作用。Li等[19]報道顯示miR-128在卵巢癌細胞中表達顯著下調,并且可引起癌細胞順鉑耐藥性明顯增強,當miR-128在卵巢癌細胞系中過表達時,可增加細胞對順鉑藥物的敏感性,表明調控卵巢癌細胞中miR-128的表達水平可能為治療該疾病的潛在靶點。Sun等[20]研究顯示miR-128在前列腺癌細胞系中的表達水平顯著下調,并引起腫瘤細胞對順鉑藥物的耐受性上升,當miR-128在上述細胞系中過表達時可增強腫瘤細胞對順鉑藥物的敏感性,同時腫瘤細胞的侵襲能力也明顯被抑制;在前列腺癌細胞系中miR-128可靶向抑制ZEB1的表達,當ZEB1表達沉默時可弱化miR-128表達下調引起的前列腺癌細胞對順鉑藥物的耐受性及侵襲能力的上升。Zhao等[21]研究顯示miR-128-3p在食管鱗狀細胞癌組織和細胞中的表達顯著下調,并與患者較差的預后相關,其研究顯示miR-128-3p可抑制癌細胞的遷移和侵襲,根據雙熒光素酶報告實驗發現miR-128-3p可靶向抑制ZEB1的表達,并且通過調控ZEB1抑制上皮細胞間質轉型和代謝。Koh等[22]報道顯示在肺癌干細胞中miR-128表達水平顯著下調,而BMI-1和MUC1-C表達水平異常上調;當miR-128在肺癌干細胞系中過表達時BMI-1和MUC1-C表達水平顯著下調,雙熒光素酶報告實驗顯示miR-128可抑制MUC1熒光素酶活性,miR-128過表達可顯著抑制癌細胞的增殖、新陳代謝活性、自我更新、遷移、侵襲和集落形成,并且可明顯促進癌細胞的凋亡。本研究顯示miR-128在ccRCC細胞中的表達水平異常下調,當ccRCC細胞中miR-128過表達時可抑制細胞的增殖和侵襲,并促進細胞凋亡;而ccRCC細胞中miR-128表達沉默時細胞增殖和侵襲能力顯著上升,細胞凋亡率明顯下降。

在細胞中,miRNAs一般通過調控功能基因的表達影響細胞的生命活動。在腫瘤細胞中,miRNAs通常調控與腫瘤發生發展相關基因的表達促進腫瘤進程。如miR-150通過調控MYB表達影響乳腺癌或結直腸癌的進程[23],miR-339-5p通過靶向調控MDM2表達影響腎癌和結直腸癌的發生發展[24]。本研究中,生物信息學分析和雙熒光素酶報告實驗顯示,miR-128與NOVA1 3′-UTR具有特異性結合位點,miR-128可抑制NOVA1活性,通過RT-qPCR和Western blot驗證顯示,miR-128可抑制ccRCC細胞中NOVA1的表達水平。

NOVA1為一種具有特異性序列的RNA結合蛋白,該蛋白有3個KH型結構域可與RNA結合,NOVA1與RNA結合的特殊位點中含有YCAY(Y為嘧啶)重復序列。近年來多項研究顯示NOVA1參與調控腫瘤的發生發展過程,而尚未有報道NOVA1在ccRCC發生發展中的作用。Zhang等[25]研究顯示NOVA1在原發性肝癌中發揮致癌作用,當NOVA1表達上調時可促進裸鼠原發性癌進程,免疫共沉淀實驗顯示NOVA1與GABAARγ2相互作用。Yoon等[26]研究顯示NOVA1在胃癌組織中表達顯著下調,低表達水平的NOVA1與胃癌患者預后較差有密切聯系,并且在胃癌細胞系中NOVA1的表達水平也顯著下調,其表達受miR-146b-5p靶向調控。Shen等[27]報道顯示miR-339在人胃癌細胞中調控NOVA1表達影響胃癌進程,miR-339可抑制胃癌的增殖和侵襲,而NOVA1表達上調時可逆轉miR-339過表達對胃癌細胞增殖和侵襲的抑制作用。Zhi等[28]研究顯示NOVA1在星形細胞瘤中受miR-181b-5p表達調控,在該腫瘤細胞中NOVA1表達水平顯著上升,并促進細胞增殖和侵襲,抑制細胞凋亡;當miR-181b-5p在星形細胞瘤中過表達時NOVA1表達顯著下調,細胞增殖和侵襲受抑制,細胞凋亡率明顯上升。而本研究顯示NOVA1在ccRCC細胞系中過表達時,細胞增殖和侵襲能力顯著上升,細胞凋亡率顯著下降;而NOVA1在ccRCC細胞系中表達沉默時,細胞增殖和侵襲能力被抑制,并且腫瘤細胞凋亡率明顯上升。此外,本研究顯示miR-128與NOVA1具有靶向結合位點,通過雙熒光素酶報告分析表明miR-128可靶向調控NOVA1在腎透明細胞癌中的表達,miR-128過表達可顯著抑制NOVA1表達,miR-128表達水平下降時,NOVA1在上述細胞中的表達水平顯著上升,NOVA1表達水平的變化可顯著調控腎透明細胞癌的增殖、侵襲和細胞凋亡。

綜上,miR-128可通過靶向調控NOVA1的表達抑制ccRCC細胞的增殖和侵襲,并促進腫瘤細胞的凋亡。本研究顯示,miR-128表達下調時可解除對NOVA1表達的抑制作用,從而促進ccRCC細胞的增殖和侵襲,并抑制細胞的凋亡。本文研究結果為ccRCC的分子機制研究提供理論基礎,也為ccRCC的治療研究提供潛在治療靶點。