止血膠對應激性潰瘍的防護作用

樊晴伶,高會軍,張靜瑜,王景杰

(空軍軍醫大學第二附屬醫院消化內科,西安 710038;*通訊作者,E-mail:jingjie@fmmu.edu.cn)

應激性潰瘍發病機制復雜[1],常規藥物治療方法是抑酸劑及黏膜保護劑的應用,若有潰瘍并出血可采用藥物治療和內鏡下治療[2],如出血局部噴灑止血劑、高頻電凝止血、激光止血、微波止血和熱凝止血等。常見止血藥物如血管收縮藥物,垂體后葉素、生長抑素及其衍生物,口服或胃內灌注止血藥如1%腎上腺素溶液及500-1 000 U凝血酶。上述治療手段經過臨床驗證,均有一定療效。但也存在一些不足之處,如往往單個藥物治療效果不好,有時需要聯合使用不同的治療措施;或存在全身性的不良反應如去甲腎上腺素有升高血壓、加快心率的作用;還有的使用不方便,如需要注射給藥或胃鏡下給藥。止血膠為我科自主研制,具有較好的臨床應用價值,主要由白芨和阿膠起到治療作用。中醫認為,白芨性味苦、澀、寒,質黏而澀,入肺、胃、肝經,功能收斂止血,消腫生肌。藥理學研究證實,白芨含大量黏液質,其中有多種聚糖,又含揮發油、淀粉,有縮短凝血時間及抑制纖溶作用,能形成人工血栓而止血[3]。阿膠的基本成分是驢皮所含膠原的降解物,善于止血,對一切失血之癥均可應用,對出血而出現的血虛癥候,應用阿膠既能止血,又能補血,有標本兼顧之效[4]。我們采用預先給予止血膠灌胃,通過觀察應激相關細胞因子血清表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)、白介素-12(interleukin,IL-2)、血小板活化因子(platelet-activating factor,PAF)變化,常規病理HE染色,黏附連接相關蛋白如黏著斑蛋白(vinculin,VCL)和黏著斑激酶(focal adhension kinase,FAK)表達的變化情況,從黏膜防御屏障探討止血膠對大鼠應激性潰瘍的預防作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要試劑

成年雄性SD大鼠30只,體質量180-220 g，均由空軍軍醫大學(原第四軍醫大學)實驗動物中心提供。外科手術器械及其余試劑為本科實驗室提供。止血膠購于唐都醫院藥劑科,鋁鎂加混懸液購于揚州一洋制藥有限公司,ELISA Kit for Rat EGF、PAF、PAF均購于上海川翔生物科技有限公司,4%多聚甲醛戊巴比妥鈉購于上海生物化學試劑公司。

1.2 動物分組及干預

將學校實驗動物中心提供的SD大鼠,正常適應性飼養7 d。使用隨機數字表將大鼠隨機分為5組,每組6只,即:正常對照組,大平臺組,單純應激組,止血膠組,鋁鎂加組。正常對照組為正常飼養;大平臺組給予大平臺飼養,在平臺上可自由活動及飲食水,自然晝夜光照;應激組使用小站臺水環境法制備模型,給予5 d應激;止血膠組給予持續睡眠剝奪5 d,每日9:00及16:00止血膠灌胃,每次1 ml,2次/d,共5 d;鋁鎂加組給予持續睡眠剝奪5 d,每日9:00及16:00鋁鎂加混懸液灌胃,每次1 ml,2次/d,共5 d。

1.3 各組潰瘍指數(UI)測定

應激時間完成后,將各組大鼠用戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉。將大鼠仰臥位固定于手術臺上,胸腹部備皮后,沿胸骨兩側肋骨緣由下向上呈梯形逐層打開胸腔,暴露心臟。用5 ml注射器插入左心室,抽取2-4 ml血液。心臟取血完成后,逐層打開腹腔,分別在胃食管連接處及幽門遠端剪下胃,取出并將其放置于生理鹽水浸濕的紗布上,沿胃大彎剪開,生理鹽水沖洗后拍照,將組織切成大小約1.0 cm×0.5 cm小塊移于4%多聚甲醛中固定。潰瘍指數按照Guth標準計算[5],即損傷程度依照胃黏膜條索狀出血壞死斑的長度計算,≤1 mm為1分,≤2 mm為2分,≤3 mm為3分,依次類推,損害寬度>2 mm者指數加倍。

1.4 各組胃黏膜HE染色

取材胃組織塊，經固定后，常規石蠟包埋，10 μm切片；每個標本切片4張。切片常規用二甲苯脫蠟，經各級乙醇至水洗：二甲苯(I)5 min→二甲苯(Ⅱ)5 min→100%乙醇2 min→95%的乙醇1 min→80%乙醇1 min→75%乙醇1 min→蒸餾水洗2 min。蘇木素染色5 min，自來水沖洗。鹽酸乙醇分化30 s(提插數下)。自來水浸泡15 min或溫水(約50 ℃)5 min。置于伊紅液中2 min。常規脫水，透明，封片：95%乙醇(I)1 min→95%乙醇(Ⅱ)1 min→100%乙醇(I)1 min→100%乙醇(Ⅱ)1 min→二甲苯石碳酸(3 ∶1)1 min→二甲苯(I)1 min→二甲苯(Ⅱ)1 min→中性樹脂封固。顯微鏡下觀察并采集圖樣儲存。

1.5 各組血清學EGF、IL-2、PAF水平檢測

將各組大鼠血清樣本逐漸復溫后,使用酶聯免疫吸附測定法(ELISA)進行EGF、IL-2、PAF水平檢測。

1.6 各組胃黏膜VCL、FAK免疫熒光組織染色

各組切片依次使用0.01 mol/L PBS分別漂洗3次后,在室溫條件下置入含0.3% Triton X-100的0.01 mol/L PBS中浸泡30 min,再經0.01 mol/L PBS液漂洗后進行免疫熒光染色。各組選2張切片,分別加入一抗即兔抗大鼠VCL單抗、兔抗大鼠FAK單抗,避光4 ℃孵育過夜(12 h)。第2日將切片置于室溫下復溫1 h,經0.01 mol/L PBS漂洗3次后,先后加入1 ∶1 000 FITC標記的驢抗兔IgG二抗及1 ∶1 000 TexasRed標記驢抗羊IgG二抗,室溫孵育3 h經PBS漂洗3次后,封片。染色完成后,用熒光顯微鏡觀察切片并采集圖樣儲存。

1.7 圖像及數據處理

2 結果

2.1 潰瘍指數

與正常對照組比較,大平臺組UI值未見明顯變化,而單純應激組大鼠的胃黏膜損傷嚴重,表現為UI明顯增加(P<0.01),給予止血膠及鋁鎂加藥物處理后,可顯著減少胃黏膜損傷程度,差異有統計學意義(P<0.05)。與鋁鎂加組相比,止血膠組的UI值差異無統計學意義(P>0.05,見表1)。

組別潰瘍指數正常對照組2.6±0.89大平臺組3.2±0.83單純應激組53.40±2.55#止血膠組11.0±2.13?鋁鎂加組13.4±1.95?

與正常對照組相比,#P<0.01;與單純應激組相比,*P<0.05

2.2 胃黏膜HE染色

正常對照組和大平臺組胃黏膜結構完整,腺體排列規律。單純應激組可見腺體排列松散,部分黏膜連接被破壞、上皮缺損,大量炎性細胞浸潤。鋁鎂加組及止血膠組腺體排列松散,但黏膜破壞及炎性細胞浸潤均較應激組減輕(見圖1)。

2.3 止血膠對睡眠剝奪大鼠血清EGF、IL-2、PAF水平的影響

與正常對照組相比,大平臺組大鼠血清EGF、IL-2、PAF水平未見明顯變化(P>0.05),而單純應激組血清EGF、IL-2表達明顯下降,PAF明顯升高,差異有統計學意義(P<0.05)。止血膠組與鋁鎂加組EGF、PAF水平與正常對照組比較,未見明顯變化(P>0.05),IL-2水平表達水平降低,統計學檢驗有意義(P<0.05);與單純應激組比較,止血膠組與鋁鎂加組EGF、IL-2水平明顯增高,PAF水平明顯下降,差異均有統計學意義(P<0.0,5見表2,圖2)。

A.正常對照組;B.大平臺對照組;C.單純應激組;D.止血膠組;E.鋁鎂加組圖1 各組大鼠胃黏膜損傷組織學比較 (HE)Figure 1 Comparison of histological changes of gastric mucosa injury among five groups (HE)

組別EGFIL-2PAF正常對照組0.49±0.164.68±0.3345.14±5.54大平臺組0.41±0.064.59±0.4848.92±5.53單純應激組0.22±0.04#1.36±0.34#86.87±10.36#止血膠組0.40±0.07?2.54±0.48?56.29±8.93?鋁鎂加組0.45±0.07?3.01±1.43?53.31±10.73?

與正常對照組相比,#P<0.05;與單純應激組相比,*P<0.05

2.4 止血膠對睡眠剝奪大鼠胃黏膜VCL、FAK表達的影響

大鼠胃黏膜VCL、FAK熒光光度值檢測結果顯示,正常對照組及大平臺組大鼠胃黏膜VCL、FAK呈穩定的高水平表達狀態。與正常對照組相比,應激組、止血膠組及鋁鎂加組VCL、FAK表達均下降,有統計學意義(P<0.05)。與應激組相比,止血膠組及鋁鎂加組VCL、FAK表達升高,差異均有統計學意義(P<0.05,見表3、圖3、圖4)。

組別 VCLFAK正常對照組89.33±6.3571.33±3.14大平臺組85.78±3.1669.33±3.55單純應激組56.33±2.58#43.33±3.51#止血膠組65.23±4.82#?54.03±2.76#?鋁鎂加組63.37±2.88#?56.21±7.29#?

與正常對照組相比,#P<0.05;與單純應激組相比,*P<0.05

與正常對照組相比,#P<0.05;與單純應激組相比,*P<0.05圖2 大鼠血清EGF、IL-2、PAF水平比較Figure 2 Comparison of serum levels of EGF,IL-2 and PAF in rats among five groups

3 討論

應激性潰瘍是指在各種應激狀態下,特別是在嚴重應激因素刺激下(全身感染、大面積燒傷、休克、多器官功能衰竭等),胃、十二指腸發生的急性、多發性黏膜淺表糜爛、潰瘍、出血等。部分嚴重病例可表現為上消化道大出血或穿孔,是各種危重疾病常見并發癥,預后不良,常常危及患者生命。其發病機制復雜,目前尚不完全明確。因其有嚴重的不良后果,預防意義大于治療。對于應激性潰瘍相關的預防研究可概括為兩種:一種是抑酸劑的預防研究[6,7],另一種是黏膜保護劑的相關研究。黏膜保護相關方面的研究主要集中在硫糖鋁、鉍劑、新型鋁鎂制劑等,近年來對于中藥對于應激性潰瘍的預防研究很受關注,如黃芪、丹參等;鋁鎂制劑,如鋁鎂加,為鎂氫氧化鋁、碳酸鹽、氫氧化鎂和水的化合物,因其有獨特的網狀結構,在酸性環境下結合膽汁酸,又可中和胃酸,在堿性環境時,又將膽汁酸釋放,從而不影響膽酸的腸肝循環,不影響營養物質的吸收。相關研究表明鋁鎂加中鎂可明顯降低胃內膽汁酸含量,且有中和胃酸的作用,能夠預防和減輕應激性潰瘍的發生。中藥相關研究表明丹參能夠有效地預防應激所致的胃黏膜損傷,其機制可能與促進內源性前列腺素的合成、釋放和抗氧化活性有關[8,9]。

黏著斑蛋白(vinculin,VCL)是一種高度保守的骨架蛋白,主要分布于鈣黏素介導的細胞-細胞連接處及整合素介導的細胞-細胞外基質連接的胞質面,并且在緊密連接中也起重要作用[10]。近年研究發現VCL與黏著斑的很多生物學功能相關[11]。FAK在細胞黏附連接中扮演著關鍵作用,通過與相應配體結合后經不同的信號轉導通路,調節細胞生存、增殖、周期調控、遷移、鋪展、凋亡及胚胎的生長發育等多個生理功能。在DSS誘發的大鼠結腸炎模型中,腸膠質細胞通過分泌proEGF,激活FAK依賴的信號通路,從而促進腸黏膜愈合[12]。炎癥因子激活FAK后可以調整細胞間局部黏附,從而改變屏障功能[13]。在腸黏膜上皮細胞的相關研究中發現,FAK在溶血磷脂酸LPA誘導的細胞遷移、板狀偽足形成及黏著斑的聚集等過程中發揮重要作用,這些功能與黏膜損傷后修復密切相關[14];TGF與細胞的修復及增殖密切相關,其部分機制可能就是通過FAK參與的,研究表明,在大鼠腸黏膜上皮細胞TGF可以增加FAK蛋白mRNA水平[15]。

止血膠是我科自主研制,并廣泛應用于平時和戰時,對于消化道出血具有很好療效的中藥復合制劑。我們主要利用了阿膠和白芨消炎、止血、生肌的作用。一般消化道止血劑在消化道活動性出血灶處不易停留,我們研制的止血膠既有止血作用,又黏附于出血部位而療效顯著。另外,從應激性潰瘍的角度來看,應激性潰瘍不但牽涉到胃腸道黏膜的損傷,而且應激導致的神經調節以及胃腸道黏膜血流甚至神經內分泌的變化等綜合因素均參與了上述變化,但是其最終的變化還是胃腸道黏膜產生了損傷性的改變,并且諸多的炎癥性因子參與其中。故此,我們針對止血膠具有很好的抗炎作用,以及毒副作用小、可安全使用的中藥特性進行研究,對于中藥的成分開發和機制研究具有十分重要的意義。