Usp9y基因在不同發育階段小鼠睪丸組織和睪丸相關細胞系中的表達特征

李蕊秀,高迎春,吳家棟,李文秀,張傳領,肖 瑞*

(1內蒙古醫科大學內蒙古自治區分子病理學重點實驗室，呼和浩特 010059；2內蒙古醫科大學研究生院；3內蒙古赤峰市醫院病理科；4內蒙古醫科大學藥學院；#共同第一作者；*通訊作者,E-mail:xiaorui79@hotmail.com)

男性不育是一種具有遺傳基礎的復雜疾病,引起不育的原因眾多,但是在不育的患者中約有11.2%的患者是屬于原發性不育[1,2]。精子發生過程中受許多基因的精細調控,基因缺失或突變均可導致精子發生過程中斷。Y染色體上的基因缺陷可導致男性生精障礙,其中無精子癥因子(azoospermia factor,AZF)區基因的突變或缺失與男性不育密切相關[3]。USP9Y基因最早被發現是AZF區的一個和男性不育有關的候選基因,經相關實驗證實位于人類Y染色體上的USP9Y基因和位于小鼠Sxrb區的Usp9y基因具有相同生物學功能[4]。USP9Y基因缺失可以引起雄性生殖細胞缺陷,導致嚴重精子發生嚴重障礙和不育,并可垂直遺傳[5]。Sun等[6]發現USP9Y基因一個4 bp堿基的缺失可產生一個截短蛋白(truncated protein),影響精子發生。蛋白結構分析和功能實驗表明,USP9Y蛋白水解酶屬于C19(細胞內肽酶)家族,通過水解精子變態過程的泛素蛋白質,促進精子細胞轉變為成熟精子,保證正常的精子發生。

泛素最初在哺乳動物的睪丸中被分離發現[7],精子發生過程中,需要泛素系統的多種成分參與,泛素-蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteasome pathway)是機體細胞內一個十分重要的調節蛋白質降解的系統,參與多種細胞活動,并在調節蛋白質數量和蛋白質活性方面起重要作用。機體通過泛素-蛋白酶體途徑調節使體內各種蛋白質達到動態平衡[8]。IVF、ICSI等技術的出現可以幫助不育患者成功受孕,然而患者精子中異倍體等異常染色體和DNA的突變,很可能增加后代的遺傳危險因素,不利于優生優育[9]。以往研究發現人類USP9Y基因主要在成人和胚胎組織包括睪丸在內的廣泛組織中均表達,而在小鼠中該基因僅在睪丸中特異性表達,因此,進一步研究小鼠組織內Usp9y基因的表達有助于明確Usp9y基因在睪丸中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑

C57BL/6J雄鼠,清潔級,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,生產許可證號:SCXK(京)2016-0006;熒光定量試劑盒(日本TaKaRa公司);反轉錄試劑盒(日本TaKaRa公司);蛋白酶抑制劑(美國Thermo公司),SDS-PAGE凝膠試劑盒(江蘇碧云天生物技術研究所)。

1.2 數據庫檢索與生物信息學分析

Usp9y基因序列來自NCBI的GenBank數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank),HomoloGene(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/homologene)數據庫用于檢索Usp9y的直系同源基因;利用ClustalW軟件(http://www.genome.jp/tools/clustalw/)進行不同種屬的Usp9y基因序列的比較。

1.3 細胞株與細胞培養

小鼠睪丸間質細胞(TM3)、人胚腎細胞(HEK293T細胞)、小鼠睪丸支持細胞(15P-1)、小鼠精原細胞(GC-1),購置于上海中科院細胞庫。HEK293T細胞、GC1細胞和15P-1細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養液中,TM3細胞培養于含5%馬血清和2.5%胎牛血清的DMEM/F12培養液中,在37 ℃、5%CO2培養箱中靜置培養,每2-3 d按1 ∶3的比例傳代,選取對數生長期的細胞提取總RNA。

1.4 小鼠組織獲取及RNA提取

選取C57BL/6J品系3,8,14,18,22,28,35,60日齡雄鼠,取睪丸并提取總RNA。取成年小鼠各組織(子宮,睪丸,心,肝,脾,肺,腎,大腦,小腦,眼球)分別提取總RNA。

1.5 RT-PCR分析C57BL/6J小鼠各個組織中Usp9y的表達

按TaKaRa RNAiso Plus Total RNA extraction regent試劑盒說明書提取總RNA,定量后取等量的RNA反轉錄為cDNA,以反轉錄產物為模板進行PCR,反應條件:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,35個循環;72 ℃延伸10 min。反應結束后取PCR產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR所用引物序列見表1,用GAPDH作內參。

表1PCR所用引物序列

Table1PrimersequencesusedforPCR

引物名稱引物序列(5′-3′) 退火溫度(℃)GAPDH-FAGGTCGGTGTGAACGGATTTG60GAPDH-RTGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA60Usp9y-FCAGCCTTCTTTCCAACAGAACC60Usp9y-RCTTTGCCGGGTCAGTATGAGG60Sycp3-FAGCCAGTAACCAGAAAATTGAGC60Sycp3-RCCACTGCTGCAACACATTCATA60

1.6 qPCR分析出生后不同日齡小鼠睪丸組織中Usp9y的表達

依照TaKaRa熒光定量試劑盒說明書,用7500fast熒光定量PCR儀(美國AB公司)進行檢測。反應體系:SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2X)10 μl,Passive ROX Reference Dye Ⅱ(50X) 0.4 μl,ddH2O 6.8 μl,上下游引物各0.4 μl,cDNA 2 μl。反應條件:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,共40個循環。用GAPDH作內參。用2-ΔΔCt法分析結果。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 Usp9y基因和蛋白生物信息學分析

數據庫檢索結果顯示小鼠Usp9y基因編碼大小為2 556個氨基酸的蛋白質(NP-683745.2),含有蛋白酶C19家族的保守結構域,USP9Y蛋白水解酶是C19(細胞內肽酶)家族一員,可以裂解泛素特異性前體和泛素化反應蛋白里的泛素。在X染色體上存在與USP9Y高度相似的同源基因USP9X,且這兩種基因在人體內普遍表達,USP9X是X染色體上編碼泛素特異性蛋白酶的基因,也是C19(細胞內肽酶)家族中一員,二者在核酸和蛋白水平上的相似程度充分說明位于X和Y染色體上的基因可能具有相似的功能(圖1A,B)。Mouse Genome Informatics數據庫分析顯示通過RT-PCR實驗發現Usp9y在胚胎期小鼠睪丸中沒有表達,只在成年小鼠(大于P10.5)的睪丸中表達;而在胚胎時期(E13.5)和新生小鼠的腦組織中可以檢測到該基因的表達,而在出生后該基因的表達僅限于睪丸組織。該蛋白在各物種間同源序列分析結果顯示在胎盤哺乳動物中,人和牛的USP9Y蛋白與小鼠的蛋白序列高度同源(見表2)。

表2人、小鼠和牛同源基因序列比較結果

Table2Comparisonresultsofhuman,mouseandbovinehomologousgenesequence

GeneIdentity(%)Species Symbol proteinDNAH.sapiensUSP9Y vs B.taurusUSP9Y90.790.0 vs M.musculusUsp9y83.085.5B.taurusUSP9Y vs H.sapiensUSP9Y90.790.0 vs M.musculusUsp9y83.785.2M.musculusUSP9Y vs H.sapiensUSP9Y83.085.5 vs B.taurusUsp9y83.785.2

*表示序列比較相同之處圖1 Usp9y和Usp9x核酸及蛋白質序列比較Figure 1 Comparison of Usp9y and Usp9x nucleic acid and protein sequences

2.2 Usp9y基因在成年C57BL/6小鼠各組織中的表達

采用RT-PCR的方法檢測成年小鼠各個組織(子宮,睪丸,心,肝,脾,肺,腎,大腦,小腦,眼球)中Usp9y基因的表達,結果顯示該基因只在睪丸中表達(見圖2)。

2.3 Usp9y基因在不同日齡C57BL/6小鼠睪丸中的表達

采用RT-PCR的方法檢測出生后不同日齡(P3、P8、P14、P18、P22、P28、P35、P60)小鼠睪丸組織中Usp9y基因的表達,結果發現不同日齡睪丸組織中均有Usp9y基因的表達(見圖3A)。采用qPCR方法檢測出生后不同日齡睪丸組織中Usp9y基因表達量的高低,結果發現Usp9y基因在小鼠出生后3 d表達最低,隨后逐漸升高,在出生后18 d最高(P<0.05),且達到最高隨后又降低,并保持穩定的表達水平(見圖3B)。

圖2 Usp9y基因在成年C57BL/6小鼠各個組織中的表達Figure 2 Expression of Usp9y gene in various tissues of adult C57BL/6 mice

圖3 Usp9y基因在不同日齡C57BL/6小鼠睪丸中的表達Figure 3 Expression of Usp9y gene in testis of C57BL/6 mice at different ages

2.4 精母細胞特異性表達因子聯會復合體蛋白3(synaptonemal complex protein-3,Sycp3)在不同日齡C57BL/6小鼠睪丸中的表達

采用q PCR方法檢測小鼠出生后不同發育階段(P3、P8、P14、P18、P22、P28、P35、P60)的睪丸特異性基因Sycp3的表達,結果顯示Sycp3與Usp9Y的表達趨勢較為相似(見圖4),該結果提示:Usp9y很可能在精母細胞中表達,且在精子發育過程中起重要調控作用,但具體定位需要使用特異性抗體檢測。

2.5 Usp9y基因在小鼠睪丸相關細胞系中的表達

采用RT-PCR方法檢測Usp9y的表達,結果顯示Usp9y基因在TM3細胞中特異性表達,在GC-1和15p-1細胞中未檢測到表達(見圖5)。

圖4 Sycp3基因在C57BL/6小鼠出生后不同時期的表達Figure 4 Expression of Sycp3 gene at different ages after birth in C57BL/6 mice

圖5 Usp9y基因在小鼠睪丸不同細胞中的表達Figure 5 Expression of Usp9y gene in different cells of mouse testis

3 討論

哺乳動物的精子發生是在睪丸的生精小管內進行,這是一個高度復雜的細胞分裂和分化過程,涉及基因的表達調控過程即轉錄和轉錄后水平的調控,其中任何一個環節出錯都可能導致雄性不育的出現[10,11]。近年來研究表明,位于Y染色體上無精子癥因子(azoospermia factor,AZF)區的USP9Y(ubiquitin specific peptidase 9,Y-linked)基因發生突變與男性不育密切相關[12],可能以正常生育或者輔助生殖的方式遺傳給后代引起不育,因此明確該基因的時空表達對于研究精子發生和雄性生殖方面具有重要的意義。

生物體內的精子發生需要機體多方面共同協調,同時需要多種睪丸特異性基因在特定時間和空間表達以保證精子發生順利進行,因此研究睪丸特異性基因的功能和表達特征對于掌握精子發生機制和明確雄性生殖障礙具有重要作用[13,14],本研究采用RT-PCR方法對小鼠體內Usp9y的表達時期和表達定位進行了初步研究,結果顯示Usp9y僅在小鼠睪丸組織中表達,與Brown等[4]研究結果相一致,提示Usp9y基因可能參與睪丸精子發生,并在睪丸組織中起到某種調節作用。

睪丸間質細胞分布在生精小管之間的結締組織中,通過合成和分泌睪酮進而促進精子發生[15],有研究表明睪丸支持細胞可以合成和分泌多種影響生殖細胞的轉運蛋白、生長因子等,睪丸間質細胞則通過自身的分泌作用影響睪丸支持細胞,而間接作用于生殖細胞[16]。本研究通過檢測Usp9y在小鼠睪丸相關細胞系中的表達,結果顯示Usp9y在小鼠睪丸間質細胞中特異性表達,未在精原細胞和支持細胞中表達,Usp9y在不同發育階段及不同生殖細胞的表達差異表明了Usp9y可能在精子發生的特定過程中發揮不可或缺的作用。

qPCR結果顯示,Usp9y在出生后3 d的小鼠睪丸中表達最低,在18 d表達量顯著增高,同時檢測Sycp3的表達,結果顯示精母細胞特異性表達因子Sycp3與Usp9y基因的表達變化較為相似。小鼠出生后3-8 d睪丸內間質較多,主要由大量支持細胞和少量精原細胞組成,睪丸間質細胞數量較少。有研究資料顯示C57BL/6小鼠在出生后15 d左右生精細胞開始出現減數分裂,生精上皮細胞主要由支持細胞、精原細胞和前細線期精母細胞組成,睪丸間質細胞數量較多,到第18日左右,生精上皮中有精原細胞、精母細胞、圓形精子細胞和支持細胞,其中粗線期精母細胞的數量顯著增加[6];這與本研究中Sycp3基因表達結果一致。

本研究通過生物信息學分析、RT-PCR、qPCR等技術,明確了Usp9y在小鼠睪丸發育過程中的表達特征,該基因可能參與精子發生的調控。進一步研究Usp9y的功能,可以為闡明Usp9y調控精子發生的分子機制和治療某些男性不育疾病提供理論依據。由于缺乏Usp9y特異性抗體,未能檢測該蛋白的表達及亞細胞定位,制定特異性單克隆抗體,將為更深一步研究Usp9y的表達與定位提供必要條件。