銀杏黃酮對大鼠學習記憶與海馬組織氧化應激的影響

張 星,曹世福,段建峰,郝銀萍,史蓓蓓

(山西醫科大學晉祠學院基礎醫學部,太原 030205;*通訊作者,E-mail:zx2001-1983@sina.com)

記憶力減退和認知障礙是包括阿爾茨海默病、抑郁癥、顱腦損傷等在內的中樞神經系統疾病的一種典型癥狀。研究發現,氧化應激是誘發記憶力減退和認知障礙的重要機制之一。李琨等[1]研究證實,參麻益智方可減少血管性癡呆大鼠海馬組織的氧化應激,減少海馬神經細胞損傷,改善大鼠的學習記憶能力。袁曉勇等[2]研究發現,刺五加注射液可增強大鼠抗氧化酶活性,提高抑郁大鼠的學習記憶能力。中草藥中的黃酮成分具有清除自由基、抗氧化、抗炎癥、抗病毒等多種生物活性和藥理作用[3,4]。其中,銀杏黃酮主要存在于銀杏葉、種皮及種仁中,含量豐富,是天然的抗氧化劑,能夠有效清除自由基、活性氧及一氧化氮等,并調節抗氧化酶的活性,減緩氧化損傷。本實驗采取腹腔注射氫溴酸東莨菪堿,建立小鼠記憶障礙模型[5],探討銀杏黃酮對學習、記憶功能障礙大鼠的改善作用,為銀杏黃酮抗氧化、抗衰老和提高記憶功能研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8周齡健康雄性清潔級SD大鼠40只,體質量(240±20)g,購自北京維通利華試驗動物技術有限公司,許可證號:SCXK(京)2012-0001。大鼠飼養在PC聚碳酸酯鼠籠內,飼養條件為:溫度20-25 ℃,濕度40%-70%;每小時換氣10-20次;光照 ∶黑暗12 h ∶12 h。正式實驗前進行適應性飼養1周。

1.2 藥品、試劑

銀杏黃酮購自徐州恒凱銀杏制品有限公司(批號:N150111),東莨菪堿購自徐州萊恩藥業有限公司(批號:H32022136)。

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)測定試劑盒,谷胱甘肽過氧化物酶(glutathioneperoxidase,GSH-Px)測試盒,總抗氧化能力(total antioxide capacity,T-AOC)測定試劑盒,丙二醛(malondialdehyde,MDA)測定試劑盒,考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒,均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 主要儀器

Morris水迷宮計算機圖像實時檢測分析處理系統購自中國醫學科學院藥物研究所,包含可移動圓形恒溫水池(直徑180 cm,高40 cm)、配套圓柱形防滑平臺(直徑9 cm,高25 cm)、溫控系統、水循環系統、視頻攝像系統,系統軟件可自動記錄大鼠運動軌跡并實現圖像的實時檢測分析與處理。680型全自動酶標儀(美國伯樂)。

1.4 分組與模型制備

大鼠正常飼養1周隨機分為4組,每組10只。對照組,灌胃生理鹽水0.2 ml,1次/d,連續5周。模型組:灌胃生理鹽水0.2 ml,1次/d,第36天開始造模,腹腔注射2 mg/kg氫溴酸東莨菪堿生理鹽水溶液0.2 ml,制備大鼠獲得性記憶障礙模型[6]。銀杏黃酮高劑量組:以銀杏黃酮溶于生理鹽水,以20 mg/kg灌胃。銀杏黃酮低劑量組:以2 mg/kg灌胃;1次/d,連續5周;第36天,灌胃銀杏黃酮,干預1 h立即對銀杏黃酮組分別腹腔注射2 mg/kg氫溴酸東莨菪堿;干預15 min立即進行空間學習記憶試驗,連續7 d。

1.5 空間學習記憶試驗

造模后第8天,開始Morris水迷宮試驗。Morris水迷宮選用圓桶,水池直徑100 cm,高40 cm,水深25 cm,水溫控制在22-24 ℃,水中加入黑色墨水,使其不透明。把水池均分為一、二、三、四個象限,并作不同的標記。選第三象限正中放置高度為23 cm、直徑8 cm的平臺,位于水面以下2 cm,試驗期間保持環境安靜、恒溫、自然光照、參照物恒定。試驗前動物適應性游泳5 min。試驗持續6 d,前5 d每天訓練4次,每次持續5 min,第6天正式試驗。

定位航行試驗:隨機從東、南、西、北四個象限邊緣選1個入水點將大鼠面向池壁放入水中。如果大鼠在2 min內找到平臺,記錄2 min內尋找平臺的時間(逃避潛伏期);如果大鼠在2 min內未找到平臺,由試驗者將大鼠輕輕引至平臺,逃避潛伏期記為2 min,并使大鼠在平臺停留10 s。

空間探索試驗:定位航行試驗全部結束后,次日撤去平臺,進行空間探索試驗。然后選第一象限相同的入水點將大鼠面向池壁放入水中,記錄其2 min內跨越原平臺位置的次數和大鼠在平臺各象限停留的時間。

1.6 海馬組織抗氧化指標測定

于試驗結束后,麻醉處死大鼠,分離海馬組織,在冰冷生理鹽水中清洗干凈后在1.5 ml Eppendorf離心管內,用眼科剪剪碎,加入9倍冰冷生理鹽水后,倒入勻漿器內快速勻漿組織。然后倒入離心管,于3 000 r/min離心10 min,取上清檢測SOD、GSH-Px、T-AOC和MDA的含量,操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 各組大鼠逃避潛伏期的比較

Morris水迷宮實驗結果顯示,隨著訓練天數的增加,各組大鼠逃避潛伏期逐漸縮短。與對照組相比,模型組大鼠的逃避潛伏期顯著延長(P<0.05);與模型組相比,銀杏黃酮低劑量組大鼠逃避潛伏期差異無統計學意義(P>0.05);銀杏黃酮高劑量組大鼠逃避潛伏期顯著縮短,差異有統計學意義(P<0.05)。與銀杏黃酮低劑量組相比,銀杏黃酮高劑量組大鼠逃避潛伏期顯著縮短,差異有統計學意義(P<0.05,見表1)。

表1各組大鼠逃避潛伏期的比較(s)

Table1Comparisonoftheescapelatencyperiodofratsamongfourgroups(s)

組別第1天第2天第3天第4天第5天對照組26.23±4.3723.65±4.6321.72±3.9419.15±4.2416.39±4.45模型組42.34±5.26?41.83±5.19?39.25±5.19?33.85±4.79?28.43±4.67?銀杏黃酮低劑量組32.54±5.1331.23±4.7530.75±4.5925.26±4.3120.33±4.35銀杏黃酮高劑量組30.26±4.49#27.82±5.06#25.41±4.73#21.41±4.34#18.86±3.72#

與對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

2.2 各組大鼠在目標象限穿梭次數與在各象限的停留時間比較

與對照組相比,模型組小大鼠在原放置平臺的象限(第三象限)內停留時間顯著縮短,差異有統計學意義(P<0.05)。在該象限的穿越次數顯著減少,差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組相比,銀杏黃酮低劑量組在原放置平臺的象限(第三象限)內停留時間和在該象限的穿越次數差異無統計學意義(P>0.05);銀杏黃酮高劑量組在原放置平臺的象限(第三象限)內停留時間顯著延長,差異有統計學意義(P<0.05)。在該象限的穿越次數顯著增多,差異有統計學意義(P<0.05)。與銀杏黃酮低劑量組相比,銀杏黃酮高劑量組在原放置平臺的象限(第三象限)內停留時間顯著延長,差異有統計學意義(P<0.05,見表2)。

表2各組大鼠在各象限停留時間與在目標象限穿梭次數的比較

Table2Comparisonoftheescapelatencyperiodandtimescroossingplatformofratsamongfourgroups

組別停留時間(s)第一象限第二象限第三象限第四象限目標象限穿梭次數對照組28.92±7.6230.87±6.5330.14±7.4830.07±4.7211.59±2.45模型組36.47±5.5427.54±4.2520.84±4.86?35.15±6.058.83±3.94?銀杏黃酮低劑量組32.41±7.8229.85±5.4824.59±7.7633.15±6.288.71±3.52銀杏黃酮高劑量組31.08±6.2731.45±5.4627.34±6.34#30.13±7.2210.26±3.78#

與對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

2.3 大鼠海馬組織中SOD、T-AOC、GSH-Px活性和MDA含量的測定結果

與對照組相比,模型組海馬組織SOD、GSH-Px、T-AOC活性顯著降低,差異有統計學意義(P<0.05);MDA含量顯著升高,差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組相比,銀杏黃酮低劑量組海馬組織SOD、GSH-Px、T-AOC活性和MDA含量差異無統計學意義(P>0.05);銀杏黃酮高劑量組海馬組織SOD、GSH-Px、T-AOC活性顯著升高,MDA含量顯著降低,差異有統計學意義(P<0.05)。與銀杏黃酮低劑量組相比,銀杏黃酮高劑量組海馬組織SOD、GSH-Px、T-AOC活性顯著升高,MDA含量顯著降低,差異有統計學意義(P<0.05,見表3)。

表3各組大鼠海馬組織中SOD、T-AOC、GSH-Px活性和MDA含量

Table3ComparisonofSOD,T-AOC,GSH-PxactivitiesandMDAcontentinhippocampaltissuesofratsamongfourgroups

組別SOD(U/mg)GSH-Px(U/mg)T-AOC(U/mg)MDA(nmol/mg)對照組178.65±19.3237.60±4.1810.55±1.292.26±0.45模型組120.38±21.43?22.31±5.63?6.27±1.43?3.95±0.63?銀杏黃酮低劑量組125.24±15.1624.55±3.797.44±1.543.27±0.56銀杏黃酮高劑量組164.74±22.14#32.16±5.82#8.78±1.85#2.58±0.42#

與對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

3 討論

腦海馬區神經細胞是動物主要的負責記憶和學習的細胞。海馬區貧血、缺氧、組織損傷及神經元壞死等病因均可造成記憶功能衰退[7,8]。研究證實腦組織氧化應激在記憶功能衰退中發揮著重要的作用[9,10]。銀杏黃酮具有抗氧化、抗炎、抗自由基等作用[11,12]。經典的Morris水迷宮試驗廣泛用于嚙齒類動物空間學習和記憶功能研究[13,14]。本試驗結果顯示,東莨菪堿造成潛伏期顯著增加,穿越目標象限平臺位置的次數減少,學習記憶能力下降;銀杏黃酮能顯著縮短大鼠尋找平臺的潛伏期,并顯著增加其穿越目標象限平臺位置的次數,表明銀杏黃酮能有效改善東莨菪堿誘導的記憶障礙大鼠模型的學習記憶能力下降。SOD和GSH-Px是機體內廣泛存在的重要的抗氧化酶,清除超氧自由基、過氧化氫、Ⅳ親雜苫等活性氧簇(ROS),在生物體發揮抗氧化作用;過量的ROS會引發脂質過氧化物MDA蓄積[15],并引起海馬神經元細胞膜損傷,導致學習記憶功能衰老及阿爾茨海默病、帕金森病等相關神經損傷疾病的發生[16]。

本研究結果顯示,東莨菪堿造成海馬組織抗氧化酶SOD、GSH-Px活性顯著下降,機體總抗氧化能力指標T-AOC顯著下降,并因此造成清除MDA能力降低和MDA含量升高。銀杏黃酮顯著升高海馬組織抗氧化酶SOD、GSH-Px活性,并提高機體總抗氧化能力指標T-AOC,表明銀杏黃酮顯著增強大鼠腦組織清除自由基的能力;并顯著降低MDA含量,減少過氧化產物對腦組織的損傷,抑制海馬組織的氧化應激,從而改善大鼠的學習記憶功能。有研究發現,銀杏黃酮能夠增加腦血管流量,改善腦血管循環功能,清除自由基、超氧陰離子及一氧化氮等自由基,調節氧化應激損傷,提高機體免疫能力[17]。鄧敏貞等[18]研究證實石菖蒲揮發油聯合人參總皂苷減少阿爾茨海默病模型小鼠海馬組織氧自由基的生成,提高腦組織SOD活性含量,降低活性和MDA含量,維持腦組織正常結構,抑制神經細胞凋亡,顯著改善小鼠學習記憶能力,對AD具有較好的防治作用。因此,銀杏黃酮能夠升高抗氧化酶活性,調節氧化與抗氧化系統平衡,增強清除氧自由基的能力,抑制氧化應激,改善學習記憶功能。