冀南地區HLA-B等位基因多態性與慢性丙型肝炎的相關性

楊志明,馬思思,李艷艷

(邯鄲市中心醫院檢驗科,邯鄲 056000)

丙型肝炎由丙型肝炎病毒(HCV)感染所致,據世界衛生組織估計,全球約有1.85億人感染HCV。在我國健康人群抗HCV陽性率為0.7%-3.1%,約3 800萬人,嚴重危害我國人口的健康。HCV感染后不同個體會表現出不同的疾病進程,這是由病毒和宿主因素共同決定的。研究發現,大約有10%-40%的HCV感染者HCV感染后自愈,其余轉化為慢性丙型肝炎,進展為肝硬化和肝癌。人類白細胞抗原(HLA)作為人體重要的免疫遺傳系統,與HCV感染病程有著密不可分的聯系,其基因多態性可能與HCV自限清除及疾病轉歸有關。國外的研究發現HCV清除與HLA-Ⅰ類或Ⅱ類等位基因有一定的相關性[1-5]。國內研究發現HCV易感性與HLA-Ⅰ或Ⅱ類等位基因相關聯[6-8]。本研究收集前來邯鄲醫院體檢的219例HCV感染者標本,分為HCV自發清除組和HCV持續感染組,采用病例對照研究,探討該地區HLA-B等位基因與HCV感染者易感性及自限清除的相關性,試圖探索保護基因和易感基因,為人類天然抗HCV機制提供線索,為HCV感染的防治工作提供新思路。本研究首次探討冀南地區HLA-B等位基因與HCV感染后自發清除的關系。

1 材料與方法

1.1 研究對象

隨機收集2013-02～2015-03來我院體檢并成功隨訪(于初次收集到標本6個月后進行隨訪再次抽取標本)的HCV感染患者219例(其中男性102例,女性117例,年齡在30-50歲之間),并且排除進行HCV治療的患者,其中69例自發清除,150例HCV持續感染;健康人群212例(其中男性98例,女性114例,年齡在30-50歲之間)。所有研究對象均取得知情同意。抽取靜脈血,離心取血清進行檢測。

HCV自發清除的判定標準:研究對象在初次調查檢測HCV抗體和HCV-RNA后,隨訪6個月以上,再次檢測指標。自發清除組患者為初次檢測標本HCV抗體陽性,初次標本和隨訪標本檢測HCV-RNA均為陰性;慢性感染組患者為初次標本檢測HCV抗體和HCV-RNA均為陽性,隨訪標本HCV-RNA仍為陽性[9,10]。

1.2 試劑與儀器

人類基因組抽提試劑盒購自天根公司,HLA-B等位基因分型天津秀鵬公司生產。儀器采用美國AB公司9700 PCR擴增儀、伯樂Gel DocTMEZ Imager全自動凝膠成像系統、北京市六一儀器廠DYY-6C型電泳儀。

1.3 方法

1.3.1 ELISA檢測HCV抗體 采用2個不同廠家的試劑盒,分別為北京萬泰生物藥業有限公司和珠海麗珠試劑股份有限公司HCV抗體酶聯免疫吸附試驗試劑盒,進行HCV抗體檢測,嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.3.2 熒光定量PCR檢測HCV-RNA 采用2個不同廠家的試劑盒,分別為圣湘丙型肝炎病毒核酸檢測定量試劑盒和上海科華丙型肝炎病毒核酸檢測定量試劑盒,進行HCV RNA檢測,嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.3.3 DNA提取 嚴格按照試劑盒說明書進行操作,純化后的DNA放在-20 ℃冰箱保存。

1.3.4 瓊脂糖電泳 HLA等位基因分型檢測采用PCR-SSP方法將提取的DNA進行擴增,擴增產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳,于紫外凝膠成像系統中成像,然后進行分析。

1.4 統計學方法

統計學分析用SPSS 16.0統計軟件進行數據分析,丙型肝炎患者與健康對照者之間、HCV感染后自發清除患者與HCV持續感染者之間HLA-B各等位基因頻率的比較采用卡方檢驗,以P<0.05為差異有統計學意義,統計軟件同時計算OR值及95%置信區間(95%CI)用于患病風險的評價。

2 結果

2.1 丙型肝炎患者與健康對照者之間HLA-B基因型的比較

結果顯示,丙型肝炎患者的HLA-B*15/35/55基因頻率明顯高于健康對照組(P<0.05),且OR值相對較高;丙型肝炎患者的HLA-B*40/58基因頻率明顯低于健康對照組(P<0.05),且OR值相對較低;其他各等位基因在兩組間的表達頻率差異均無統計學意義(P>0.05,見表1)。

表1丙型肝炎患者與健康對照者之間HLA-B等位基因頻率的比較例(%)

Table1ComparisonofHLA-BallelesfrequencybetweenpatientswithhepatitisCandhealthcontrolscases(%)

等位基因 HCV感染(n=219)健康對照(n=212)χ2POR(95%CI)HLA-B?1325(11.4)29(13.7)0.500.480.81(0.46-1.44)HLA-B?1546(21.0)28(13.2)4.6050.0319 1.717(1.045-2.921)HLA-B?3519(8.7) 8(3.8)4.4090.0358 2.423(1.036-5.662)HLA-B?37 4(1.8) 5(2.4)0.150.700.77(0.20-2.91)HLA-B?38 5(2.3) 6(2.8)0.130.720.802(0.24-2.67) HLA-B?4016(7.3)31(14.6)5.940.0120.46(0.24-0.87)HLA-B?4414(6.4)12(5.7)0.1020.751.14(0.51-2.52)HLA-B?46 6(2.7)13(6.1)2.940.0860.43(0.16-1.16)HLA-B?48 9(4.1) 8(3.8)0.0320.861.09(0.41-2.89)HLA-B?5124(10.9)22(10.4)0.0380.841.06(0.58-1.96)HLA-B?5218(8.2)13(6.1)0.7030.4021.37(0.65-2.87)HLA-B?54 7(3.2)14(6.6)2.700.100.47(0.18-1.18)HLA-B?5516(7.3) 4(1.9)7.150.008 4.10(1.35-12.47)HLA-B?57 4(1.8) 3(1.4)0.110.731.29(0.29-5.86)HLA-B?58 6(2.7)16(7.5)5.140.020.34(0.13-0.90)

2.2 HCV感染后自發清除患者與HCV持續感染者之間HLA-B等位基因頻率的比較

根據HCV自發清除的判定標準,分為HCV感染后自發清除組和HCV持續感染組。結果顯示,HCV感染后自發清除組患者的HLA-B*15/40等位基因頻率明顯高于HCV持續感染組患者(P<0.05),且OR值相對較高;HCV感染后自發清除組患者的HLA-B*55等位基因頻率明顯低于HCV持續感染組患者(P<0.05),且OR值相對較高;其他各等位基因在兩組間的表達頻率差異均無統計學意義(P>0.05,見表2)。

3 討論

據世界衛生組織(WHO)統計,全球HCV的感染率約為2.8%,并呈現日益增長的趨勢[11]。由于缺乏預防性疫苗且治療費用昂貴,丙型肝炎的預防和治療仍然為世界范圍內重大的公共衛生難題。HCV感染的整個過程非常隱匿,而且感染者在初期大多無明顯的臨床癥狀。HCV能夠逃逸宿主的免疫系統進而建立持續性感染,其中15%-40%的HCV急性感染者可在6個月內清除感染,在感染清除的過程中,有可能HCV RNA水平很低不能檢出,僅抗-HCV陽性;而65%-80%的患者病毒持續6個月仍未被清除,稱為慢性HCV感染,進而進展為肝硬化和肝癌,為人類健康帶來了嚴重危害。病毒自發清除的機制尚不明確。有研究指出不同個體的遺傳背景及機體免疫反應對HCV病毒的清除有著至關重要的作用,但目前國內關于宿主遺傳背景對于HCV感染后自發清除的相關研究很少。

表2HCV感染后自發清除患者與HCV持續感染者之間HLA-B等位基因頻率的比較例(%)

Table2ComparisonofHLA-BallelesfrequencybetweenpatientswithspontaneousremovalafterHCVinfectionandpatientswithHCVpersistentinfectioncases(%)

等位基因HCV感染自發清除組(n=69)HCV持續感染組(n=150)χ2POR(95%CI)HLA-B?13 5(7.2)20(13.3)1.730.190.51(0.18-1.42)HLA-B?1520(29.0)26(17.3)3.870.0490.95(1.00-3.81)HLA-B?35 5(7.2)14(9.3)0.260.610.76(0.26-2.20)HLA-B?37 1(1.4) 3(2.0)0.080.780.72(0.07-7.06)HLA-B?38 1(1.4) 4(2.7)0.3140.580.54(0.06-4.90)HLA-B?40 9(13.0) 7(4.7)4.900.0273.06(1.09-8.61)HLA-B?44 5(7.2) 9(6.0)0.120.731.22(0.39-3.80)HLA-B?46 2(2.9) 4(2.7)0.010.921.09(0.19-6.10)HLA-B?48 2(2.9) 7(4.7)0.370.540.61(0.12-3.02)HLA-B?51 5(7.2)19(12.7)1.420.230.54(0.19-1.51)HLA-B?52 7(10.1)11(7.3)0.490.481.43(0.53-3.85)HLA-B?54 3(4.3) 4(2.7)0.430.511.66(0.36-7.63)HLA-B?55 1(1.4)15(10.0)5.100.0240.13(0.02-1.02)HLA-B?57 2(2.9) 2(1.3)0.640.422.21(0.30-16.0)HLA-B?58 1(1.4) 5(3.3)0.630.430.43(0.05-3.72)

HLA基因定位于6號染色體短臂上,是迄今所知人類基因組性最豐富的遺傳系統。HLA作為人體重要的免疫遺傳系統,在對機體免疫應答反應的啟動和調節控制上發揮至關重要的作用,與許多疾病的發生、發展相關。對各類疾患人群進行HLA基因型別和頻率的分析對疾病機制的研究具有重要啟示作用。HLA-Ⅰ、Ⅱ類基因表達產物主要存在于有核細胞表面,其限制性抗原呈遞能激活細胞毒性T淋巴細胞,在抗病毒免疫中發揮重要作用[12]。HLA-B是HLA-Ⅰ類分子中最為復雜、多態性最多的區域,已有研究表明HLA-B與乙肝慢性化有一定的相關性[13]。

國外許多研究發現HLA分子基因型與HCV感染轉歸密切相關,有研究發現DRB1*11:01與HCV感染后自發清除正相關[14],另有研究結果顯示DRB1*03:01在自發清除組中較為常見,DQB1*06:02在慢性感染者中比例較高[15]。國內研究也發現在廣州地區獻血人群中DQB1*11:01與HCV感染后自發清除正相關[16]。國外也有研究提示HLA-Ⅰ類分子與逆轉錄病毒感染轉歸相關。有研究提出HLA-B*57及HLA-B*27與HIV感染后病毒清除相關[17],在HCV感染中發現HLA-A*03、HLA-A*02、HLA-B*27、HLA-B*07、HLA-B*57與病毒清除有關,而HLA-A*01、HLA-B*08、HLA-B*18則與HCV持續感染有關[18,19],國內也有研究證明HLA-B*40可能加速AIDS疾病進程[20]。這些研究提示國內人群HLA-B基因多態性可能也與HCV易感性及感染后病毒自發清除有關。

本研究結果示,丙型肝炎患者與健康對照者之間HLA-B等位基因表達頻率相差較大,其中丙型肝炎患者的HLA-B*15/35/55等位基因頻率明顯高于健康對照組,差異有統計學意義(P<0.05),表明HLA-B*15/35/55等位基因可能為HCV感染的易感基因;丙型肝炎患者的HLA-B*40/58等位基因頻率明顯低于健康對照組,差異有統計學意義(P<0.05),表明HLA-B*40/58等位基因可能為HCV感染的拮抗基因,對機體有一定的保護作用。但需要指出的是,由于樣本僅限于冀南地區人群,且樣本量有限,因此HLA-B低頻率基因座容易漏檢,從而會影響等位基因頻率的準確性。今后應加大樣本的檢測量及檢測人群范圍,開展功能性機制研究來驗證,提高HLA-B基因型與HCV疾病進展相關性分析的精確性。

本研究結果提示,HCV感染后自發清除組患者的HLA-B*15/40等位基因頻率明顯高于HCV持續感染組患者(P<0.05);HCV感染后自發清除組患者的HLA-B*55等位基因頻率明顯低于HCV持續感染組患者(P<0.05);其他各等位基因在兩組間的表達頻率差異均無統計學意義(P>0.05)。分析HLA-B分子與病毒感染轉歸相關的主要原因,可能是因為HLA-B類分子遞呈胞內小肽給CD8+T淋巴細胞,進而影響CD8+T細胞的活化,在清除病毒感染中發揮舉足輕重的作用。

綜上所述,本研究采用病例對照研究分析了冀南地區人群HLA-B等位基因多態性與HCV感染后自發清除的相關性,旨在探尋中國人群宿主遺傳背景對HCV感染自愈及慢性化的影響,為后續篩選符合中國人群的基于基因水平的HCV治療性以及預防性疫苗的研發提供一定理論基礎,為科學和個體化的HCV防治提供依據。