線粒體乙醛脫氫酶影響心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌線粒體功能和室性心動過速的機制

王 英,劉 敏,于波濤,王敬東

(青島市中心(腫瘤)醫(yī)院,青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科,青島 266003;*通訊作者,E-mail:617324523@qq.com)

心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI)是臨床上常見的心血管疾病,主要表現(xiàn)為心肌代謝紊亂、心功能低下以及細胞超微結(jié)構(gòu)破壞等,嚴重威脅著人們的健康[1]。MIRI是指冠狀動脈阻塞一定時間后,心肌缺血再灌注后所出現(xiàn)的心臟結(jié)構(gòu)和功能障礙,嚴重時導(dǎo)致慢性心力衰竭和死亡[2-4]。目前,治療急性心肌梗死的方式主要為溶栓治療,但治療后常出現(xiàn)MIRI,因此,如何緩解MIRI是研究的首要任務(wù)[5]。研究證實,室性心動過速、線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激以及心肌細胞凋亡均是導(dǎo)致MIRI的主要因素[4]。乙醛脫氫酶(ALDH)有兩種亞型:線粒體型和胞質(zhì)型,其中線粒體ALDH即為ALDH2,是一種廣泛分布于人體組織器官中的四聯(lián)體蛋白[6]。ALDH2是線粒體中重要的醛類氧化酶,而乙醇是ALDH2的非特異性激動劑[7,8]。近年來,關(guān)于ALDH2對心肌缺血再灌注損傷的保護作用引起了廣泛關(guān)注。ALDH2是一種具有保護心臟功能的酶,能清除心肌代謝中產(chǎn)生的毒性醛類[9]。本實驗通過建立心肌缺血再灌注損傷大鼠模型,采用ALDH2激動劑乙醇觀察ALDH2高表達后,對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌線粒體功能和室性心動過速的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

實驗動物:健康雄性SD大鼠60只,體質(zhì)量為400-600 g,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。生長溫度為(23±2)℃,環(huán)境濕度為45-50%,光照時間為每天12 h,自由進食、進水,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

主要試劑:心肌線粒體提取試劑盒、SOD和MDA的ELISA檢測試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)研究所;羅丹明123購自Sigma公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒及ECL發(fā)光試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所;ALDH2抗體、Caspase-3抗體和β-actin抗體均購自Abcom公司;其余為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組及給藥 選取60只健康雄性SD大鼠,隨機分為3組:假手術(shù)(sham)組、MIRI model組和ALDH2組,每組20只。ALDH2組在建模之前,大鼠給予2.5%乙醇(乙醛脫氫酶2激動劑)日常飲用,1周后乙醇調(diào)整至5%,持續(xù)8周。然后建立大鼠心肌缺血再灌注(MI/R)模型。

1.2.2 心律失常監(jiān)測 采用標準肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖連續(xù)監(jiān)測大鼠室性心動過速的發(fā)生率及其持續(xù)時間。室性心動過速的診斷標準:3個或3個以上連續(xù)出現(xiàn)畸形、增寬的QRS波群,QRS間期>0.12 s,其前無固定P波,心室率120-200次/min,節(jié)律略不規(guī)則,心房率少于心室率,可見房室分離、心室奪獲或心室融合波。

1.2.3 ELISA法測定大鼠心肌組織中SOD和MDA的含量 實驗結(jié)束后,各組大鼠立即進行斷頭處死。在無菌條件下取各組大鼠的心肌組織,并使用無菌Hank’s緩沖液洗滌2次。準確稱取200 mg心肌組織,剪碎后放入勻漿管中,并加入2 ml生理鹽水進行冰浴勻漿。3 500 r/min離心15 min后,收集上清液待測。使用ELISA檢測試劑盒測定大鼠心肌組織中SOD和MDA的含量。具體操作步驟嚴格按照試劑和說明書進行。

1.2.4 流式細胞儀測定各組大鼠心肌細胞的線粒體膜電位 制備大鼠心肌細胞單細胞懸液。取1×105個細胞,1 000 r/min離心5 min,PBS洗滌沉淀2次。加入0.5 ml的羅丹明123染色液,充分混勻。將細胞置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育15 min。孵育結(jié)束后,4 ℃下600×g離心5 min,PBS洗滌沉淀2次。使用500 μl的PBS緩沖液重懸細胞,使用流式細胞儀測定各組大鼠心肌細胞的線粒體膜電位的變化情況。

1.2.5 q-PCR法檢測大鼠心肌組織中Bax的mRNA表達 實驗結(jié)束后,對各組大鼠進行斷頭處死,并分離出各組大鼠的心肌組織。采用組織勻漿機對心肌組織進行充分研磨。采用Trizol提取法提取血管中的總RNA,按照Micro RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書對總RNA進行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系為20 μl ∶1 μl總RNA,4 μl 5×Reaction Mix,2 μl 10×Super Script Enzyme Mix,加入雙蒸水將體系補足至20 μl,混勻后離心。反應(yīng)條件為:37 ℃ 60 min,95 ℃ 5 min,置于4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂肧YBR Green染料法進行測定,每個樣本設(shè)置4個復(fù)孔。按照q-PCR試劑盒說明書進行轉(zhuǎn)錄擴增,反應(yīng)體系為20 μl。基因的相對表達用2-ΔΔCt法進行計算。

1.2.6 Western blot檢測大鼠心肌組織中ALDH2的蛋白表達 實驗結(jié)束后,各組大鼠立即進行斷頭處死。在無菌條件下取各組大鼠的心肌組織,并使用無菌Hank’s緩沖液洗滌2次。提取心肌組織蛋白,采用Western blot檢測心肌組織中ALDH2和Caspase-3的蛋白表達水平。使用BCA蛋白濃度試劑盒對蛋白進行定量。選取5%的濃縮膠和10%的分離膠,取20 μl蛋白樣品進行上樣,電泳結(jié)束后,將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。使用10%的脫脂乳粉溶液進行封閉2 h后,一抗(1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜。使用TBST洗膜三次,每次15 min,二抗(1 ∶4 000)室溫孵育2 h,用TBST洗膜三次。使用化學(xué)發(fā)光法對蛋白進行顯色。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠室性心動過速的測定

心律失常測定顯示,與sham組相比,model組大鼠室性心動過速的發(fā)生率升高(P<0.01),其持續(xù)時間較長(P<0.01);而ALDH2組大鼠室性心動過速的發(fā)生率較model組降低(P<0.01),其持續(xù)時間較短(P<0.01,見表1)。說明ALDH2激動劑乙醇可抵抗大鼠心肌缺血再灌注損傷引起的室性心動過速。

組別n室性心動過速 發(fā)生率(%) 室性心動過速 持續(xù)時間(s) sham組2000.00±00.00 00.00±00.00model組2086.63±7.74??144.68±11.72??ALDH2組2038.94±5.16## 36.95±4.18## F55.656 71.230 P0.0000.000

與sham組相比,**P<0.01;與model組相比,##P<0.01

2.2 ELISA法測定大鼠心肌組織中SOD和MDA的含量

ELISA測定顯示,與sham組相比,model組大鼠心肌組織中SOD的含量降低(P<0.01),MDA的含量升高(P<0.01);而ALDH2組大鼠心肌組織中SOD的較model組升高(P<0.01),MDA的含量降低(P<0.01,見表1)。說明ALDH2激動劑乙醇可緩解大鼠心肌缺血再灌注損傷引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

組別nSOD(U/mg)MDA(nmol/mg)sham組2021.42±0.924.02±0.46model組2010.66±0.73??8.63±0.62??ALDH2組2014.95±0.62##5.45±0.53## F22.06513.724 P0.0030.012

與sham組相比,**P<0.01;與model組相比,##P<0.01

2.3 流式細胞儀測定各組大鼠心肌細胞的線粒體膜電位

采用陽離子綠色熒光染料羅丹明123對線粒體的膜電位進行檢測,結(jié)果見表3。與sham組相比,model組大鼠心肌線粒體膜電位降低(P<0.01),而ALDH2組大鼠心肌線粒體膜電位較model組升高(P<0.01,見表3)。說明心肌細胞凋亡時會導(dǎo)致線粒體膜電位降低以及功能變化,而ALDH2激動劑乙醇可緩解線粒體的損傷情況。

組別n線粒體膜電位未降低細胞所占百分比(%)sham組2093.43±5.73model組2045.75±4.64??ALDH2組2068.45±4.57## F25.237 P0.001

與sham組相比,**P<0.01;與model組相比,##P<0.01

2.4 q-PCR法檢測大鼠心肌組織中Bax的mRNA表達

q-PCR測定結(jié)果見圖1與表4。與sham組相比,model組大鼠心肌組織中Bax mRNA表達上調(diào)(P<0.01);而ALDH2組大鼠心肌組織中Bax的mRNA表達低于model組(P<0.01)。說明ALDH2激動劑乙醇可有效抑制心肌缺血再灌注導(dǎo)致的心肌細胞凋亡。

圖1 q-PCR法檢測大鼠心肌組織中Bax的mRNA表達Figure 1 Bax mRNA expression in rat myocardium by q-PCR

組別nBax mRNA相對表達sham組201.00 model組201.53±0.14??ALDH2組201.15±0.11## F11.392 P0.008

與sham組相比,**P<0.01;與model組相比,##P<0.01

2.5 Western blot檢測大鼠心肌組織中ALDH2的蛋白表達

如圖2和表5所示,與sham組相比,model組大鼠心肌組織中ALDH2的蛋白表達下調(diào)(P<0.01);而ALDH2組大鼠心肌組織中ALDH2的蛋白表達高于model組(P<0.01)。說明ALDH2激動劑乙醇可使MIRI大鼠心肌組織中ALDH2的蛋白表達增加。

1.ALDH2組；2.model組；3.sham組圖2 Western blot檢測大鼠心肌組織中ALDH2的蛋白表達Figure 2 Protein expression of ALDH2 in rat myocardium by Western blot

組別nALDH2/β-actin ALDH2組201.11±0.12## model組200.93±0.11 sham組200.29±0.08?? F15.426 P0.002

與sham組相比,**P<0.01;與model組相比,##P<0.01

2.6 Western blot檢測大鼠心肌組織中Caspase-3的蛋白表達

如圖3和表6所示,Western blot測定顯示,與sham組相比,model組大鼠心肌組織中Caspase-3蛋白表達上調(diào)(P<0.01);而ALDH2組大鼠心肌組織中Caspase-3蛋白表達低于model組(P<0.01)。說明ALDH2激動劑乙醇可降低MIRI大鼠心肌組織中相關(guān)凋亡蛋白Caspase-3的蛋白表達。

3 討論

心肌缺血再灌注損傷(MIRI)是臨床常見的心血管疾病,常表現(xiàn)為室性心動過速,心功能不全及血壓驟降等[10]。因此,如何避免和緩解MIRI的發(fā)生成為了當(dāng)前研究的熱點。線粒體乙醛脫氫酶2(ALDH2)作為機體內(nèi)重要的醛類氧化酶,可減輕細胞的氧化損傷,保護心肌細胞,抑制心肌細胞凋亡[11-13]。在本研究中,通過建立心肌缺血再灌注損傷大鼠模型,采用ALDH2激動劑乙醇觀察ALDH2高表達后,對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌線粒體功能和室性心動過速的作用機制。心電圖可作為評價心肌缺血再灌注損傷的重要指標。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),心肌缺血再灌注損傷發(fā)生后,大鼠室性心動過速的發(fā)生率升高且持續(xù)時間較長,而長期給予ALDH2激動劑乙醇干預(yù)后,可降低大鼠室性心動過速的發(fā)生率及持續(xù)時間,提示ALDH2激動劑乙醇可抵抗大鼠心肌缺血再灌注損傷引起的室性心動過速。

1.model組；2.ALDH2組；3.sham組圖3 Western blot檢測大鼠心肌組織中Caspase-3的蛋白表達Figure 3 Protein expression of Caspase-3 in rat myocardium by Western blot

組別nCaspase-3/β-actin sham組200.13±0.04 model組200.95±0.14?? ALDH2組200.45±0.09## F17.722 P0.004

與sham組相比,**P<0.01;與model組相比,##P<0.01

氧化應(yīng)激是心肌缺血再灌注后導(dǎo)致心肌損傷的主要原因,MDA作為氧化應(yīng)激的標志物,其含量可間接反應(yīng)氧自由基對心肌脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的程度[14]。SOD是一種可清除機體內(nèi)氧自由基的特異性酶,其活性可反映機體的抗氧化能力[15,16]。本研究發(fā)現(xiàn),心肌缺血再灌注損傷發(fā)生后,大鼠心肌組織中SOD的含量降低,MDA的含量升高,說明心肌缺血再灌注損傷導(dǎo)致了機體氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生。同時,長期給予ALDH2激動劑乙醇干預(yù)后,大鼠心肌組織中SOD的含量升高,MDA的含量降低,說明ALDH2激動劑乙醇可緩解大鼠心肌缺血再灌注損傷引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)。在心肌缺血再灌注損傷中,線粒體膜電位的變化也與心肌缺血再灌注損傷有著密切的關(guān)系[17]。在本研究中發(fā)現(xiàn),心肌缺血再灌注損傷后,大鼠心肌線粒體膜電位降低,說明心肌細胞凋亡時會導(dǎo)致線粒體膜電位降低以及功能變化;而長期給予ALDH2激動劑乙醇干預(yù)后,大鼠心肌線粒體膜電位升高,說明ALDH2激動劑乙醇可緩解線粒體的損傷情況。

心肌細胞凋亡是心肌缺血再灌注損傷的表現(xiàn)之一,在細胞凋亡信號途徑中,Bax是促凋亡蛋白,當(dāng)Bax降低后,可導(dǎo)致前凋亡因子(細胞色素c)釋放到胞質(zhì),從而激活Caspase 3,啟動凋亡程序[18]。本研究發(fā)現(xiàn),心肌缺血再灌注損傷后,大鼠心肌組織中Bax mRNA升高,而長期給予ALDH2激動劑乙醇干預(yù)后,大鼠心肌組織中Bax mRNA降低,說明ALDH2激動劑乙醇可有效抑制心肌缺血再灌注導(dǎo)致的心肌細胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn),心肌缺血再灌注損傷后,大鼠心肌組織中Caspase-3蛋白表達上調(diào),而長期給予ALDH2激動劑乙醇干預(yù)后,大鼠心肌組織中Caspase-3蛋白表達下調(diào),說明ALDH2激動劑乙醇可使MIRI大鼠心肌組織中ALDH2的蛋白表達增加,并且降低相關(guān)凋亡蛋白Caspase-3的蛋白表達。

綜上所述,ALDH2激動劑乙醇可增強ALDH2在MIRI大鼠心肌組織中的表達,并對MIRI有保護作用,其機制可能與抵抗室性心動過速、緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)、提高心肌組織中線粒體膜電位及抑制細胞凋亡的發(fā)生有關(guān)。