宮頸癌組織中miR-216b 與FOXM1 表達及與臨床病理特征的關系

王夢漪 盧宏達 陳 莉 雷 章

華中科技大學同濟醫學院附屬武漢市中心醫院腫瘤科，湖北武漢 430014

宮頸癌是常見的女性惡性腫瘤之一，在所有女性惡性腫瘤中排第三位，死亡率較高，嚴重危害女性健康［1］。手術治療和局部放療是目前主要治療方案，但晚期患者治療效果不佳，5 年生存率較低［2］。因而，有必要進一步研究其發生發展的分子機制。微小RNA（miR）是長度為18～25 個核苷酸的內源性非編碼RNA 調控因子，參與細胞分化、細胞周期凋亡調控和細胞遷移等［3］。宮頸癌中存在多種miR 的異常表達現象，且miR 可通過調節下游靶基因的表達，參與腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移等惡性生物學過程［4-5］。有研究報道顯示［6］，長鏈非編碼RNAXLOC_008466 可作為分子海綿結合miR-216b，調控癌細胞的增殖及遷移。然而miR-216b 在宮頸癌中的表達及相關機制研究鮮有報道。叉頭框蛋白M1（FOXM1）參與細胞的有絲分裂過程，該蛋白異常表達可導致因紡錘體缺陷引起的有絲分裂過程的延遲，進而影響癌細胞的增殖［7］。本研究中，通過檢測宮頸癌組織中miR-216b 及FOXM1 表達情況，分析兩者之間的相關性，初步探討其作用機制及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016 年3 月～2019 年3 月華中科技大學同濟醫學院附屬武漢市中心醫院（以下簡稱“我院”）診治的宮頸癌患者84 例作為病例組，同期選取我院診治的宮頸上皮內瘤變（CIN）患者40 例作為CIN 組，經病理確診為子宮肌瘤患者40 例作為對照組。病例組年齡34～65 歲，平均（55.7±5.4）歲；病理類型：宮頸鱗癌63 例，子宮腺癌21 例；分化程度：高分化19 例，中分化32 例，低分化33 例；腫瘤分期參考2009 年國際婦產科協會（FIGO）制定的標準［8］：ⅠA2 期13 例，ⅠB1 期12 例，ⅠB2 期17 例，ⅡA1 期13 例，ⅡA2 期10 例，ⅢA 期12 例，ⅢB 期7 例；浸潤深度：淺肌層例34 例，深肌層50 例；伴淋巴結轉移13例，無淋巴結轉移71 例；人乳頭瘤病毒（HPV）16/18 陽性70 例，陰性14 例。CIN 組年齡35～65 歲，平均（55.5±5.8）歲；腫瘤分期：ⅡA1 期12 例，ⅡA2 期10 例，ⅢA期12 例，ⅢB 期6 例。對照組年齡42～66 歲，平均（54.7±5.1）歲。三組年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經我院醫學倫理委員會批準。

納入標準：①均經活檢病理或術后病理學檢查確診；②均為初次診治；③臨床病理及隨訪資料完整；④患者均知情同意且簽署知情同意書。排除標準：①合并其他器官惡性腫瘤；②合并上呼吸道感染等感染性疾病；③合并嚴重的心、肝等臟器功能不全。

1.2 方法

收集術中切取的部分病理組織，液氮速凍后，置于-80℃冰箱保存。取約30 mg 組織標本，Trizol 法提取總RNA。以5μL總RNA為模板，使用TaqManMicro-RNA 反轉錄試劑盒（美國ABI 公司，批號：20160219）進行逆轉錄合成cDNA。miR-216b 特異性莖環引物，正向引物：5′-GCCGCGCTAAAGTGCTTA-3′，反向引物：5′-CACCAGGGTCCGAGGT-3′，U6 上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，下游引物：3′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-5′，FOXM1 上游 引物：5′-CCGCTCGAGGGACTGTTCTGCTCCTCATAG-3′，下游引物：5′-ATAAGAATGCGGCCGCTGGCAGTCTCTGGATAATGATC-3′。熒光定量PCR 反應條件為：94℃，4 min；94℃，30 s；60℃，1 min；72℃，30 s；共40 個循環。總反應體系共20 μL，包括cDNA 2 μL，TaqDNA 聚合酶0.25 μL、上下游引物各0.1 μL、10×PCR緩沖液2.5 μL、10 mmol/L dNTPs 0.5 μL，ddH2O 補至20 μL。所有反應均在實時定量PCR 儀（美國ABI 公司）上完成，每個樣本重復3 次。采用相對Ct 值方法進行數據分析，miR-216b 表達水平相對于內參基因U6 的比值為2-ΔΔCt，且ΔCt=CtmiR-216b-CtU6，FOXM1相對定量表達水平ΔCt=CtFOXM1-CtU6。

1.3 觀察指標

觀察三組miR-126b 及FOXM1 表達情況，miR-126b 及FOXM1 表達與臨床病理特征之間的關系及其相關性分析。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析、SNK-q 法檢驗，兩組間比較采用t 檢驗；相關性分析采用Pearson 線性相關分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組miR-126b 及FOXM1 表達比較

病例組miR-126b 表達水平顯著低于CIN 組及對照組，FOXM1 表達水平顯著高于CIN 組及對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。CIN 組miR-126b水平顯著低于對照組，FOXM1 水平顯著高于對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。見表1。

表1 三組miR-126b 及FOXM1表達比較（±s）

表1 三組miR-126b 及FOXM1表達比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.01；與CIN 組比較，#P＜0.01。miR-126b：微小RNA-216b；FOXM1：叉頭框蛋白M1；CIN：宮頸上皮內瘤變

2.2 miR-126b 及FOXM1 表達與臨床病理特征之間的關系

miR-126b 及FOXM1 表達與FIGO 分期、腫瘤分化程度及浸潤深度有關（P＜0.05），與年齡、病理類型、有無淋巴結轉移及有無HPV 16/18 感染無關（P＞0.05）。見表2。

2.3 相關性分析

miR-126b 水平與FOXM1 水平呈負相關（r=-0.694，P=0.001）。

表2 miR-126b 及FOXM1 表達與臨床病理特征之間的關系（±s）

表2 miR-126b 及FOXM1 表達與臨床病理特征之間的關系（±s）

注：miR-126b：微小RNA-216b；FOXM1：叉頭框蛋白M1；FIGO：國際婦產科協會；HPV：人乳頭瘤病毒

3 討論

宮頸癌是致死率最高的婦科惡性腫瘤之一，中晚期患者預后更差。近年來，隨著對宮頸癌分子機制研究的深入，新生物學標志物的發現及新技術的臨床應用，患者的生存率提高，死亡風險降低［9］。但目前宮頸癌發生發展的分子機制尚不清楚，仍需尋找關鍵的診斷和治療的分子生物靶點。研究顯示，多種miRNA 如miR-375、miR-101 參與調控子宮頸癌細胞的增殖、遷移及侵襲過程［10-11］。miR-216b 在胰腺癌、乳腺癌等多種腫瘤中均存在表達異常，參與腫瘤的增殖、浸潤和轉移等過程的調控［12-13］。

本研究結果顯示，病例組miR-126b 表達水平低于CIN 組及對照組，提示miR-126b 可能作為一種腫瘤抑制性miR，參與宮頸癌的發生發展過程。有學者在Hela、SiHa 及C33A 等宮頸癌細胞系中也發現miR-126b 表達下調現象［14］，與本研究結果一致。但miR-126b 過表達可促進腫瘤細胞的增殖并抑制凋亡過程。目前miR-126b 表達下調的機制尚不清楚，可能與編碼基因的突變或其他因子轉錄后調控有關。有研究報道［15］，長鏈非編碼RNA CCAT2 可以作為分子海綿結合miR-126b，抑制miR-126 功能，促進腫瘤細胞的增殖和轉移。miR-126b 可以靶向調控自噬相關基因Beclin-1 和LC3-Ⅱ的表達［16］，Beclin-1 表達下降和LC3-Ⅱ表達升高共同導致細胞自噬功能降低，促進腫瘤的發生發展。本研究結果顯示，FIGO 分期越高、分化越差、肌層浸潤越深，miR-126b 水平越低，提示miR-126b 水平能夠反映病情嚴重程度，有可能成為新的相關腫瘤標志物。

FOXM1 在促進細胞周期G1/S 期和G2/M 期轉換中發揮重要作用。本研究結果顯示，病例組FOXM1 表達水平高于CIN 組及對照組，提示其可能與FOXM1 mRNA 的3′非編碼區的miR 結合減少有關。在膠質瘤中，miR-876-5p 結合FOXM1 mRNA 后，抑制FOXM1表達，進而抑制腫瘤的進展［17］。此外，FIGO 分期越高、分化越差、肌層浸潤越深，FOXM1 表達水平越高，提示FOXM1 可反映疾病嚴重程度、提示不良預后等。

高危型HPV 感染，如HPV 16、18 型，是宮頸癌發病的重要原因。本研究結果顯示，HPV 感染與miR-126b 及FOXM1 表達水平無明顯相關性，提示單純HPV 感染并非是導致宮頸惡性轉變的唯一因素，其他病因如基因突變、遺傳易感性等均可能參與宮頸癌的發生發展［18］。此外，本研究結果顯示，miR-126b 水平與FOXM1 水平呈負相關，提示FOXM1 可能作為miR-126b 的靶基因，受到miR-126b 的負向調控。骨肉瘤組織中也發現miR-126b 能結合FOXM1 mRNA的3′非編碼區，抑制FOXM1 mRNA 的翻譯過程，進而抑制腫瘤的增殖、浸潤和轉移［19-20］。但一種miR 可能存在多種靶基因，宮頸癌中FOXM1 是否是miR-126b的靶點及二者是否在宮頸癌發生發展過程中發揮關鍵作用，有待深入研究。

綜上所述，宮頸癌組織中miR-126b 及FOXM1均異常表達，兩者共同參與宮頸癌的發生發展過程，有可能成為宮頸癌診斷、治療及預后評估的新腫瘤標志物。