血清miR-181b、miR-210 表達與妊娠期高血壓疾病患者炎性因子的關系

任 娜 季景環

河北省滄州市人民醫院婦產科，河北滄州 061000

妊娠期高血壓疾病（HDP）是妊娠期婦女的常見疾病，在我國發病率為5%～10%，以高血壓和蛋白尿為主要特征，是僅次于產后出血導致孕產婦死亡的原因［1］。HDP 發病機制尚不完全清楚，早期診斷并評估病情的嚴重程度，是臨床制訂有效干預方案，減少HDP病情進展的重要手段。微小RNA（miR）是一類高度保守的非編碼小分子RNA，長度為21～23 個核苷酸，參與調控細胞的增殖、生長、分化、凋亡、免疫應答、惡性腫瘤的發生發展等生理病理過程［2］。miR-181b、miR-210是常見的miR 分子，主要參與缺血性腦卒中等疾病的發病過程［3］，但其在HDP 發病過程中的作用相關報道較少。研究［4］發現，HDP 發生發展過程中，炎癥細胞合成、炎性因子分泌貫穿整個環節。本研究通過檢測血清miR-181b、miR-210 水平，旨在探討其與HDP 患者的表達水平及與炎性因子的關系。現報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016 年1 月～2018 年1 月河北省滄州市人民醫院（以下簡稱“我院”）收治183 例HDP 單胎孕婦為病例組，同期選取55 名健康孕婦為對照組。兩組一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。見表1。根據HDP 診斷與分類標準［5］將病例組分為3 個亞組，妊娠期高血壓亞組51 例，輕度子癇前期亞組79 例，重度子癇前期亞組53 例。本研究經我院醫學倫理委員會批準，患者及家屬均知情且簽署知情同意書。

納入標準：①符合《婦產科學》（第7 版）［5］中關于HDP 的診斷與分類標準；②單胎妊娠孕婦；③規律產檢，臨床資料完整者。排除標準：①心臟功能不全者；②肝、腎功能障礙者；③雙胎及以上者；④合并妊娠期糖尿病者；⑤急慢性炎性反應疾病者；⑥自身免疫性疾病者；⑦母體或胎兒為艾滋病或病毒陽性者；⑧胎兒先天性畸形的孕婦；⑨合并其他可能影響本研究結果的疾病。

表1 兩組基線資料比較（±s）

表1 兩組基線資料比較（±s）

1.2 方法

1.2.1 血清miR-181b、miR-210 相對表達量檢測

1.2.1.1 主要試劑和儀器 RNA 提取試劑盒（美國Invitrogen公司，生產批號：20151126），美國Invitrogen 公司提供的PrimeScript? RT reagent Kit（生產批號：20150923）和QuantiFast? SYBR? Green Pcr Kit（生產批號：20151107），引物（上海捷瑞生物工程有限公司），5415R 型小型低溫高速離心機（德國Eppendorf公司），C1000 型Bio-Rad PCR 儀（美國BIORAD 公司），UV1900PC 型紫外分光光度計（常州三豐儀器科技有限公司）。

1.2.1.2 血清miR-181b、miR-210 檢測 提取RNA：抽取兩組肘靜脈血5 mL，常溫下靜置30 min 后，3000 r/min離心10 min，離心半徑為12 cm，取血清置于-80℃環境下保存。血清中加入1 mL Trizol RNA，提取總RNA，紫外分光光度計檢測RNA 總純度，比值在1.8～2.0，說明樣本合格。反轉錄試劑盒將總RNA 反轉錄為cDNA，miR-181b 正向引物序列：5′-AACATTCATTGCTGTCGGTGGG-3′，反向引物序列：5′-GCGAAGCACAGAATTAATACGACTCAC-3′，長度為78 bp；miR-210正向引物序列：5′-CAATAACTGTGCGTGTGACAGC-3′，反應引物序列：5′-TATGGTTGTTCTCGTCTCCTTCTC-3′，長度為77 bp；內參基因U6 正向引物序列：5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，反向引物序列：5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′，長度為70 bp。反轉錄的反應體系為20 μL，包括內參基因U6 3 μL 和miR 特異性莖環引物，模板RNA 5 μL，100 mmol/L 的dNTPs 0.15 μL，50 U/μL 的反轉錄酶1.0 μL，20 U/μL的RNase 抑制劑0.19 μL，10×反轉錄緩沖液1.5 μL，無菌不含酶的蒸餾水4.16 μL。逆轉錄條件：16℃，30 min；42℃，30 min；85℃，10 min；將提取的cDNA 在4℃的冰箱中保存。qRT-PCR 法：以cDNA 為模板，建立20 μL qRT-PCR反應體系，包括2×定量PCRMasterMix10μL，引物及探針Mix 1 μL，cDNA 模板1.33 μL，無核酸酶的蒸餾水7.67 μL。反應條件：95℃預變性3 min，95℃變性12 s，60℃復性40 s，72℃延伸20 s，持續40 個循環。實驗重復3 次后取平均值，計算miR-181b、miR-210 相對表達量，以2-△△Ct表示，△Ct=Ct（miR-181b/miR-210）-Ct（U6）。

1.2.2 血清炎性因子水平檢測

酶聯免疫吸附法檢測血清白細胞介素（IL）-1β、IL-6、IL-10、IL-17 及腫瘤壞死因子-α（TNF-α），操作過程嚴格按照試劑盒（上海科新生物技術股份有限公司，批號：20151023、20150609）說明進行。

1.3 統計學方法

采用SAS 9.4 統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 檢驗，兩組間比較采用t 檢驗；計數資料用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗；相關性分析采用Pearson 積矩相關分析。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組血清miR-181b、miR-210 及炎性因子水平比較

病例組血清miR-181b、miR-210 及IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α 水平均高于對照組，IL-10 水平低于對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。見表2。

2.2 不同HDP 亞組血清miR-181b、miR-210 及炎性因子水平比較

不同HDP 亞組血清miR-181b、miR-210 及IL-1β、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α 比較，差異均有統計學意義水（均P＜0.05）；輕度子癇前期亞組miR-181b、miR-210 及IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α 高于妊娠期高血壓亞組，IL-10 低于妊娠期高血壓亞組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；重度子癇前期亞組miR-181b、miR-210 及IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α 高于輕度子癇前期亞組，IL-10 低于輕度子癇前期亞組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。見表3。

表2 兩組血清miR-181b、miR-210 及炎性因子水平比較（±s）

表2 兩組血清miR-181b、miR-210 及炎性因子水平比較（±s）

注：miR-181b：微小RNA-181b；miR-210：miR-210；IL-1β：白細胞介素-1β；IL-6：白細胞介素-6；IL-10：白細胞介素-10；IL-17：白細胞介素-17；TNF-α：腫瘤壞死因子-α

表3 不同HDP 亞組血清miR-181b、miR-210 以及炎性因子水平比較（±s）

表3 不同HDP 亞組血清miR-181b、miR-210 以及炎性因子水平比較（±s）

注：與妊娠期高血壓亞組比較，*P＜0.05；與輕度子癇前期亞組比較，#P＜0.05。miR-181b：微小RNA-181b；miR-210：微小RNA-210；IL-1β：白細胞介素-1β；IL-6：白細胞介素-6；IL-10：白細胞介素-10；IL-17：白細胞介素-17；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；HDP：妊娠期高血壓疾病

2.3 Pearson 積矩相關分析

HDP 患者血清miR-181b 與IL-1β（r=0.722，P＜0.01）、IL-6（r=0.759，P＜0.01）、IL-17（r=0.713，P＜0.01）、TNF-α（r=0.736，P＜0.01）呈正相關，與IL-10（r=-0.781，P＜0.01）呈負相關。HDP 患者血清miR-210 與IL-1β（r=0.765，P＜0.01）、IL-6（r=0.793，P＜0.01）、IL-17（r=0.738，P＜0.01）、TNF-α（r=0.772，P＜0.01）呈正相關，與IL-10（r=-0.745，P＜0.01）呈負相關。

3 討論

HDP 是僅在妊娠期發生的嚴重并發癥，多數患者病情較輕，少數嚴重患者可出現抽搐、昏迷、心力衰竭、腎功能不全以及胎盤早剝等嚴重并發癥，嚴重者可致死亡［6］。HDP 發病機制復雜，是遺傳因素、免疫失衡、血管內皮細胞損傷、滋養細胞缺血等多種因素共同作用的結果［7］。miR 是在真核生物中廣泛存在且在組織中的表達具有特異性的內源性非編碼RNA，可發揮抑制目標miR 分子翻譯活性的功能［8］。研究［9］顯示miR 介導細胞的增殖、分化、凋亡以及免疫應答過程，同時參與激素的分泌及神經發育、惡性腫瘤細胞的發生發展等病理生理過程。

miR-181b 參與中樞神經系統疾病、心血管疾病、免疫性疾病以及惡性腫瘤的發病。Zhang 等［10］發現，miR-181b 在癲癇持續狀態的大鼠模型海馬組織中呈低水平表達，并且通過Notch 信號通路，對抗凋亡基因Nrarp 起到負調控作用。蘇顯都等［11］發現，miR-181b表達上調介導精神分裂癥發病過程，可作為評估精神分裂癥患者病情改善、治療效果及預測預后的潛在靶向指標。Sun 等［12］通過動物實驗證實，小鼠炎性反應過程及血管內皮損傷時血清miR-181b 表達異常，由此推斷其參與動脈粥樣硬化過程。姚育紅等［13］證實，miR-181b 作為促癌基因在胃癌組織中表達上調，并與惡性腫瘤的侵襲和轉移密切相關。miR-210 基因位于人體11 號染色體上，屬于缺氧激活因子，當機體出現缺血缺氧時，組織miR-210 表達上調，促進新生血管的形成［14］。Ma 等［15］在構建缺血缺氧性腦損傷大鼠模型中增加miR-210 模擬物，大鼠腦水腫明顯加重，而抑制miR-210 表達則可減少腦損傷，miR-210 在新生大鼠缺血缺氧性腦損傷的神經保護中發揮重要功能。齊京鵬等［16］發現，miR-210 通過調控靶基因介導胃癌的發病過程，有望成為診斷胃癌的靶向指標。陸蕓瑤等［17］證實，乳腺癌患者惡性腫瘤細胞不斷增殖形成缺氧環境，激活組織中miR-210 的表達。另有研究［18］顯示，miR-210 參與缺血性腦卒中后的炎性反應過程，還與子癇前期的發病密切相關。

本研究結果顯示，miR-181b、miR-210 在HDP 患者中表達上調，隨著HDP 病情嚴重程度的增加，其表達水平上調明顯，提示miR-181b、miR-210 參與了HDP 發病過程。此外，病例組血清促炎因子IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α 水平顯著高于對照組，抑炎因子IL-10 低于對照組，并且病情越重，促炎因子水平越高，抑炎因子水平越低，與馬彩蓮等［19］研究結果相似。HDP 發病時誘導機體釋放大量促炎因子，激活炎性反應，損傷血管內皮細胞，使血管通透性增加，臟器缺氧缺血；IL-10 作為抑炎因子，可使機體的免疫反應降低，使促炎因子合成并分泌。多種炎性因子通過級聯反應破壞胎盤細胞因子間的動態平衡，進而參與HDP 整個發病過程。因此，早期檢測炎性因子有助于臨床評估HDP 病情嚴重程度。

Pearson 積矩相關分析發現，HDP 患者血清miR-181b、miR-210 與IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α 呈正相關性，與IL-10 呈負相關性，提示miR-181b、miR-210可能通過介導炎性反應過程而參與HDP 發病過程。miR-181b 在內皮細胞NF-κB 信號通路介導的炎性反應過程中發揮重要作用，促進促炎因子的合成和釋放，加重血管炎性反應，損傷血管內皮細胞，最終參與HDP 發病［20］。miR-210 作為缺氧激活因子，通過相應靶位可激活相應信號通路，促進機體發生氧化應激反應，導致免疫調節紊亂，誘發促炎因子大量釋放，抑制抑炎因子釋放，最終參與HDP 發病過程［21］。

綜上所述，miR-181b、miR-210 通過介導炎性因子的釋放而參與HDP 發病過程，并且與病情嚴重性密切相關。