Rab26對小細胞肺癌H446細胞增殖和遷移的影響

陳 偉 李 華 唐心蔚 劉雪萍

支氣管肺癌是嚴重威脅人類健康的常見疾病，在惡性腫瘤中，發病率和死亡率占居首位[1]。目前經過手術和傳統的化療及放療肺癌仍難以控制，且副作用大，五年生存率僅為15%～20%[2]。小細胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)是肺癌中重要的病理類型，占肺癌的15%～20%，惡性程度較高，雖然其對化療敏感性較高，但是由于分化差、增殖快且極易發生轉移，導致對藥物易產生耐藥性[3]。因此，尋找新的治療途徑和靶標，是小細胞肺癌治療的關鍵。Rab26是Rab家族近年來新發現的成員，主要參與細胞的黏附、運動、分裂和基因轉錄[4]。既往研究表明，Rab26可以促進腫瘤細胞凋亡，并抑制其遷移[5]，在對抗腫瘤的生長發展中有著重要作用，但是在小細胞肺癌中的研究尚無報道。因此，本文以Rab26過表達質粒載體和siRNA序列作用小細胞肺癌H446細胞，觀察Rab26對H446細胞增殖及細胞遷移的影響，旨在為小細胞肺癌的防治提供新的治療靶點。

材料與方法

一、實驗材料

Rab26過表達質粒(pDsRed monomer C1載體)和siRNA(序列：GUGUUA- CCCAUGCCUACUATT UAGUAGGCAUGGGUAACACTT，Cy3標記)由生工構建，1649完全培養基、OptiMEM、胰蛋白酶購自HyClone公司(美國)，轉染試劑購自羅氏公司，RNA提取試劑、RT-PCR試劑盒、質粒提取試劑盒購自北京天根生物技術公司，Rab26、GAPDH抗體購于艾博抗貿易有限公司。

二、實驗方法

1. H446細胞的培養: H446細胞置于37 ℃、含5% CO2的1 640培養基(含5%標準胎牛血清)的培養箱中培養。每次實驗所需細胞均選擇對數生長期的細胞。

2. 細胞轉染: 實驗分為對照細胞組、Rab26質粒過表達組、Rab26siRNA組。接種H446細胞接種于6孔板了培養1 d(1×105個/孔)，顯微鏡下觀察腫瘤細胞生長融合情況，待腫瘤細胞達60%的融合率時進行轉染，且在進行細胞轉染時先用PBS洗滌6孔板，更換培養基為Opti-MEM，同時分別將質粒、siRNA與轉染試劑按照比例稀釋(參照說明書)，對照組則加入等量稀釋液培養液。6 h后更換為完全培養基，置于細胞培養箱中繼續培養。

3. 流式細胞儀檢測轉染效率: 0.25%的胰酶處理轉染后的H446細胞，以離心半徑8 cm，2 000 r/min 離心10 min，棄上清，PBS洗滌細胞2次，加入300 μl PBS重懸細胞，混勻，待流式細胞儀檢測。

4. RT-PCR檢測Rab26 mRNA的表達: Trizol提取總RNA，Rab26引物上游: 5′-TCAAGGGCGGCAGCAGGA-3′，下游: 5′-GAGTACGCCCAGCACGAC-3′；GAPDH引物上游: 5′-GCAAATTCCAC GGCACAGTCA-3′，引物下游: 5′-TCACGCCACAGTTTCCCAGAG-3′。按照RT-PCR 試劑盒進行逆轉錄，其中Rab26 擴增長度為298 bp，GAPDH擴增長度為450 bp，條件參照既往文獻[5]。

5. Western blot 檢測Rab26蛋白的表達: 提取總蛋白，4 ℃，以離心半徑8 cm，12 000 r/min 離心10 min，檢測總蛋白濃度，按需要調蛋白濃度，向蛋白液中加入Loading buffer，煮沸8 min變性。配制分離膠、濃縮膠，SDS-PAGE凝膠電泳，80 V 40 min，120 V 1.0 h后，350 mA轉膜45 min，將PVDF膜封閉2 h后，加入一抗4 ℃孵育過夜；第二天TBST漂洗至少3次，每次10 min，孵二抗1 h，TBST漂洗后顯色。

6. MTT檢測H446細胞增殖: H446細胞接種于96孔板內(1×103/孔)，加入200 μl培養液，各組設4個復孔，置于培養箱內培養24 h，再進行細胞轉染，分別于轉染后24 h和48 h后，向每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，再培養4 h后，棄上清液，加入150 μl 二甲基亞砜(DMSO)，混勻。490 nm波長下測定細胞生長活力，計算光密度值。細胞生長活力=[實驗組光密度值/對照組48 h光密度值]× 100%。

7. 劃痕實驗檢測H446細胞遷移: H446細胞接種于6孔板內(1×105/孔)，待細胞在孔內融合率達100%后，用tip頭在6孔板中央畫直線。并用PBS洗滌1次，繼續加入10%FBS的1 640完全培養基，同時顯微鏡下照相記錄0 h位置；24 h后，更換培養基后照相，觀察各組腫瘤細胞遷移情況；48 h，重復觀察。

常用的混合材有：火山灰、粉煤灰、?；郀t礦渣、煤矸石、沸石、石灰石、石英巖、爐渣、硅錳渣、硫酸鋁渣等。有些材料的內比表面積大，如沸石、硫酸鋁渣吸水量大，爐渣、礦渣呈多孔結構，這些材料與外加劑的相容性均較差。

三、統計學方法

使用SPSS 15.0 for windows 和Image-Pro Plus 10.0對數據和圖像進行分析，每組別至少重復3次實驗，兩組間比較采用t檢驗方法，P<0.05表示差異有統計學意義。

結 果

一、Rab26過表達質粒和siRNA轉染H446細胞轉染效率

各組轉染48 h后，Rab26質粒過表達組轉染效率達(76.8±4.3)%；siRNA組轉染效率為(79.5±3.57)%，見圖1，結果表明轉染效率較高，為后續實驗提供較好的數據支撐。

圖1 各組轉染H446細胞的轉染效率

二、Rab26在基因和蛋白水平的改變

轉染48 h后，檢測每組Rab26在mRNA和蛋白水平的表達情況，發現質粒過表達組Rab26 mRNA和蛋白表達較對照組顯著增加(P<0.05)，而Rab26 siRNA組在mRNA和蛋白水平表達較對照組表達均顯著減少(P<0.05)，見圖2。結果表明為有效轉染，在基因和蛋白水平都發揮效應。

圖2 各組間Rab26mRNA和蛋白表達；注： *:P<0.05，與正常組比較

三、Rab26對H446細胞增殖的影響

圖3 各組細胞存活率；注：*:P<0.05，與對照24 h比較；#：P<0.05，與對照48 h比較

四、Rab26對H446細胞遷移的影響

劃痕實驗結果顯示對照組、質粒過表達組、siRNA組轉染24 h后，遷移速度分別為(0.53±0.03)μm/min、(0.21±0.04)μm/min、(0.61±0.02)μm/min；轉染48 h后各組遷移速度分別為(0.32±0.04)μm/min、(0.22±0.04)μm/min、(0.42±0.03)μm/min，在24、48 h時過表達組細胞遷移速度顯著低于對照組(P<0.05)，siRNA組在24、48 h時遷移速度則顯著高于對照組，見圖4。

討論

近年來肺癌的發生呈逐年上升趨勢，且呈年輕化，嚴重影響人們的生活質量。尤其是隨著我國經濟的快速發展，環境污染導致的霧霾天氣在全國各地出現的頻率亦越來越高，也引發肺癌的發病率和死亡率日趨增加，約2/3的患者在診斷時發現已出現遠處轉移。目前小細胞肺癌的治療手段主要是化療及放療，盡管近年來其治療策略也處于不斷探索和發展中，一定程度上提高了小細胞肺癌治療的緩解率，但是對改善患者的生存期仍是極為有限。據統計，廣泛期和局限期小細胞肺癌的5年生存率僅有2%和10%，且局限期患者的中位生存時間僅為18～20個月，廣泛期患者的中位生存時間則僅有8～12個月[6-7]。因此，亟待探索新的治療策略以提高肺癌患者的生存期和生活質量。

研究表明肺癌的發生發展受多因子、多因素、多階段控制，其中癌細胞的增殖和凋亡失衡，以及早期的轉移是癌癥發生的重要原因[8]，其中增殖和轉移為惡性腫瘤的最主要特征。已知腫瘤細胞的增殖能力增強主要由于細胞的增殖失控所致，因此抑制腫瘤細胞的生長和繁殖是控制腫瘤增殖的關鍵； 而腫瘤遷移的過程主要包括腫瘤細胞的極化以及偽足生成，進而偽足與細胞外基質的黏附，導致細胞體收縮、周期基質和細胞尾端解離，最終引起腫瘤細胞向前運動，同時腫瘤侵襲和轉移亦是導致肺癌患者預后不良，5年生存率低的主要原因[9-11]。Rab26屬于Ras超家族，首次被發現于小鼠胰腺細胞中，其調控胰腺細胞中溶酶體的釋放[12-14]。后期研究又發現其可以通過激活MIST1調節溶酶體的轉運，并參與細胞內的囊泡運輸，在細胞囊泡內順式轉運中發揮重要作用[15-17]。既往研究表明Rab26除了參與細胞的囊泡運輸，介導細胞內受體的轉運之外，在細胞的凋亡、自噬、遷移等生命進程也扮演了重要角色[18-22]。

圖4 各組細胞遷移情況

本文結果發現Rab26在H446細胞中有表達，且通過轉染過表達質粒、siRNA的作用可調控Rab26 在mRNA和蛋白水平的表達變化，提示Rab26可能在肺癌細胞的發展進程中有重要作用。在進一步的實驗中發現轉染Rab26過表達質粒后H446細胞的增殖減弱，而轉染Rab26 siRNA后則促進了H446細胞的增殖，表明Rab26可以抑制H446細胞的增殖；本實驗結果還顯示Rab26過表達質粒組細胞的遷移也顯著受到抑制，Rab26 siRNA組則加速了H446細胞的遷移能力，表明Rab26可有效抑制H446細胞的遷移，提示Rab26在調控H446細胞的增殖和遷移能力中有重要作用，其有望作為小細胞肺癌細胞的一個潛在靶點。

鑒于細胞增殖和轉移在腫瘤的發生、發展中的重要作用，因此通過抑制腫瘤細胞的增殖和遷移則成為腫瘤治療的重要方向。我們的實驗證實了Rab26在小細胞肺癌中伴有重要角色，早期的研究表明，Rab家族其他成員與腫瘤的遷移和侵襲有密切關系。目前已發現Rab5參與肺癌的侵襲和轉移，可降低腫瘤細胞分化性并促進侵襲轉移的能力[23-25]；Rab39和Rab21參與腫瘤細胞中胞內定位及內涵體的轉運，同時促使腫瘤的侵襲和黏附[26-27]；Rab25和Rab8與胃癌細胞的遷移、侵襲密切相關[28-29]；Rab11和Rab13參與腫瘤細胞偽足的形成，進而調控腫瘤的轉移侵襲[30-31]。可見，除Rab26 以外，其他Rab蛋白在腫瘤的發生發展中也發揮了重要作用，并進一步影響細胞的增殖、分化、凋亡，進而決定細胞的生命進程[32]。因此，結合Rab蛋白的囊泡轉運作用，研究Rab蛋白在腫瘤中的作用和機制可為肺癌患者的治療提供新的思路。