lncRNA PACER促進膿毒癥急性肺損傷炎癥反應的實驗研究

史柳嫣 辛 偉 位全芳 甘志新 王 丹 胡明冬

急性肺損傷(acute lung injury, ALI)是常見的、發病率和病死率極高的肺部疾病，以肺部嚴重的急性炎癥性反應為特征，因此，有效地抗炎治療是防治ALI的重要策略之一[1]。近年來，與炎癥反應密切相關的長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA, lncRNA)在ALI中的重要作用倍受關注。LncRNA是一類長度大于200nt的非編碼RNA，lncRNA的異常表達與多種疾病相關，如炎癥、腫瘤、心血管疾病、神經系統疾病、代謝疾病等，并密切參與調節這些疾病的發生、發展[2-7]。最近的研究發現，lncRNA PACER(p50-associated COX-2 extragenic RNA)可被細菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)顯著誘導，通過活化NF-κB 促進重要促炎因子COX-2(環氧合酶2)表達，密切參與并促進炎癥反應[8-11]。然而，lncRNA PACER在ALI 發生中的可能作用及相關機制未見報道。因此，本文在膿毒癥所致急性肺損傷患者的肺泡巨噬細胞中及LPS致ALI小鼠肺組織中PACER表達均顯著升高的基礎上，進一步觀察PACER對ALI的影響并探討其意義，旨在為深入闡明lncRNA PACER在ALI中的作用與機制提供實驗依據，并為進一步明確PACER作為ALI防治的靶標奠定實驗基礎。

材料與方法

一、實驗材料

SPF級C57BL/6小鼠，8周齡(購于陸軍軍醫大學(第三軍醫大學)動物中心)。THP-1、RAW264.7細胞(購自中科院上海細胞庫)。LPS購自美國 Sigma 公司。real time RT-PCR檢測試劑盒(美國Promega公司)。RNA提取試劑購、M-MLV逆轉錄酶(美國Invtrogen公司)。ELISA檢測試劑盒購自R&D公司。過表達及敲低PACER慢病毒由上海吉凱公司合成。PCR引物由上海生工公司合成。

二、實驗方法

1. 人肺泡巨噬細胞分離培養： 20例急性肺損傷和健康非吸煙者經支氣管肺泡灌洗術，獲得肺泡灌洗液，經4 ℃ 1 000×g 離心10 min后，去除清液，PBS重懸細胞、再離心、洗滌2次，細胞再用無血清RPMI 1640 培養液制成細胞懸液，于培養皿中，置于37 ℃ 5% CO2培養箱孵育貼壁2 h，除去未黏附細胞，黏附生長在培養皿壁的細胞即為肺泡巨噬細胞，細胞用含有10% FBS，100 U/ ml 青霉素100 μg/ ml 鏈霉素的RPMI1640 液培養。

2. ALI 小鼠模型建立與分組、處理： 按照每只小鼠10 mg/kg LPS 的劑量，進行腹腔注射，小鼠注射LPS后出現寒戰，呼吸頻率加快，活動力降低，毛發聳立、解稀水樣糞便等癥狀。將小鼠隨機分為正常組(sham)和模型組，其中模型組又分為對照組(control siRNA)、敲低組(PACER siRNA)，每組10只。正常組腹腔注射生理鹽水0.2 ml；對照組腹腔注射LPS制備膿毒癥小鼠模型，于0.5 h后，生理鹽水組尾靜脈注射生理鹽水0.2 ml；敲低組腹腔注射LPS制備膿毒癥小鼠模型，于0.5 h后，尾靜脈注射PACER siRNA慢病毒0.2 ml。

3. HE染色觀察肺臟組織的病理學改變： 取各處理小鼠肺臟組織，置于4% 的多聚甲醛中固定24 h，然后用石蠟包埋，制成5 μm 切片并做HE 染色，最后在倒置顯微鏡下觀察肺臟組織的病理學變化。

4. Real time PCR： 采用TRizol 試劑RNA提取試劑，根據試劑說明方法，提取人肺泡巨噬細胞和小鼠肺組織的總RNA。經M-MLV逆轉錄酶，按照試劑說明將RNA逆轉錄成cDNA后，以 cDNA 為模板，按照試劑說明，進行實時熒光定量 PCR實驗，檢測人和小鼠PACER、IL-6、TNF-α mRNA的表達。引物如下： hPACER F: 5’-TGTAAATA GTTAATGTGAGCTCCACG-3’，R: 5’-GCAAATTCTGGCCATCGC-3’；hIL-6 F: 5’-CAATGA GGAGACTTGCCTGG-3’，R: 5’-GGCATTTGTGGTTGGGTCAG-3’；hTNF-α F: 5’-TCTGGG CAGGTCTACTTTGG-3’，R: 5’-GGTTGAGGGTGTCTGAAGGA-3’；mPACER F: 5’-TCTGTACTGCGGGTGGAACA-3’，R: 5’-CAATTTGCCTGGTGAATGATTC-3’；mIL-6 F: 5’-AGTTGCCTTCTTGGGACTGA-3’，R: 5’-TCCACGATTTCCCAGAGAAC-3’；mTNF-α F: 5’-CAAACCACCAAGTGGAGGAG-3’，R: 5’-GTGGGTGAGGAGCACGTAGT-3’，內參照β-引物序列如下： hβ-actin F: 5’-GTGAAGGTGACAGCAGTCGGTT-3’，R: 5’-GAAG TGGGGTGGTTTTAGGA-3’；mβ-actin F: 5’-TGTTACCAACTGGGACGACA-3’，R: 5’-GGGG TGTTGAAGGTCTCAAA-3’。

5. 細胞和血清炎性因子的檢測： 采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測細胞和小鼠血清TNF-α和IL-6水平，嚴格按照試劑盒所附說明書的操作步。

三、統計學方法

結 果

一、lncRNA PACER在ALI患者和小鼠模型中表達顯著升高

20例膿毒癥所致急性肺損傷患者和健康非吸煙者經支氣管肺泡灌洗術，獲得肺泡巨噬細胞；LPS誘導的小鼠ALI模型(n=10)，取肺組織，real-time PCR檢測lncRNA PACER的表達，結果顯示相對于正常組，ALI患者(見圖1A)和小鼠ALI模型組(圖1B)，lncRNA PACER表達均顯著升高。

圖1 lncRNA PACER在ALI患者(A)和小鼠(B)模型中的表達；與Control 組比較，**P<0.01

二、lncRNA PACER促進細胞炎癥因子表達，

過表達PACER慢病毒感染人單核THP-1和鼠巨噬細胞RAW264.7細胞后，與對照組比較，過表達組細胞炎癥因子TNF-α、IL-6的表達均升高，其靶基COX-2的表達也顯著升高，見圖2 A-C；而細胞轉染PACER siRNA 后，炎癥因子TNF-α、IL-6的表達均降低，COX-2的表達也顯著降低，見圖2D-F。

三、敲低lncRNA PACER減弱ALI小鼠炎癥反應

LPS致ALI小鼠，尾靜脈注射PACER siRNA慢病毒后，檢測小鼠肺組織和血清炎性因子TNF-α、IL-6的表達，結果顯示，與對照組比較，PACER敲低組小鼠肺組織和血清中炎性因子TNF-α、IL-6的表達均顯著降低，見圖3A，3B，同時，PACER敲低組小鼠肺組織損傷程度明顯減弱，見圖3C-E。

討論

本研究首次發現，在膿毒癥所致急性肺損傷患者的肺泡巨噬細胞中及LPS致ALI小鼠肺組織中PACER表達均顯著升高，進一步研究發現PACER可促進炎性細胞因子表達，以及ALI小鼠的炎癥反應和肺損傷，為進一步明確PACER作為ALI防治的靶標奠定了實驗基礎。

ALI是各種直接和間接因素導致的肺泡上皮細胞及毛細血管內皮細胞損傷，形成彌漫性肺間質及肺泡水腫，所導致的急性低氧性呼吸功能不全，其發展至嚴重階段為死亡極其高的急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)[12]。ALI/ ARDS的發生與體內一系列基因表達調控的失調密切相關，因此進一步探討其病理過程中基因表達的調控機制對ALI/ARDS的防治具有重要的理論意義和臨床價值。

炎癥及其更為嚴重的膿毒癥(sepsis)是導致ALI/ARDS的主要因素之一。因此，有效地抗炎治療是防治ALI/ARDS的重要策略之一。近年來，與炎癥反應密切相關的lncRNA在ALI中的重要作用倍受關注。目前大量的研究發現，lncRNA在生物學過程中充當多種媒介(如充當分子支架、分子向導、分子誘餌、信號通路的調節劑等)，其通過影響染色質結構、可變剪接調控、表觀遺傳修飾、轉錄后和翻譯調控等多種機制參與機體正常和病理生理過程[13-17]。研究發現lncRNA也密切參與了ALI的發生發展過程。據報道lncRNA CASC2通過調節miR-144-3p/AQP1軸減少肺泡上皮細胞促進ALI的發展[18-21]。抑制LncRNA MALAT1可上調miR-146a進而減弱ALI 的炎癥反應[22]。脂質受體激動劑BML-111可通過抑制lncRNA MALAT1的表達減弱ALI[23]。在本實驗中發現，在膿毒癥所致ALI患者和小鼠ALI模型中lncRNA PACER表達均顯著升高，提示lncRNA PACER參與了ALI的炎癥反應。

圖2 lncRNA PACER促進細胞炎癥因子的表達結果；注：與NC，Control 組比較，**P<0.01

圖3 敲低lncRNA PACER減弱ALI小鼠炎癥反應(HE×100)；注：與Control 組比較，**P<0.01

PACER是新近發現的一個可激活環氧酶-2(COX-2)表達的lncRNA。COX-2密切參與炎癥、腫瘤等多種病理生理過程。在炎癥、損傷和致癌物質等刺激下，COX-2在巨噬細胞、單核細胞、成纖維細胞、內皮細胞等細胞中表達增加，進而促進炎癥因子表達，促進腫瘤細胞生長和轉移。研究表明，多個通路可誘導COX-2的表達，包括通過激活PKC、Ras和Wnt通路中MAPK激酶(ERK、JNK、p38)[24-28]。此外，在COX-2啟動上轉錄因子如NF-κB、AP1、CREB C/EBP、NF-IL6、MEF2、TCF4/LEF1等也可促進COX-2的轉錄活化，誘導其表達[29-30]。而新近的研究發現，lncRNA PACER 在COX-2的上游與抑制COX-2的啟動子NF-κB p50相結合，轉而促進組蛋白乙酰轉移酶p300的募集，轉而促進COX-2的表達。那么該作用機制是否與ALI的發生發展相關，以及lncRNA PACER在ALI中的具體作用尚不清楚。因此，在我們的實驗中發現，在LPS刺激人單核THP-1和鼠巨噬細胞RAW264.7細胞中，PACER可顯著誘導炎癥因子的表達，且其重要靶基因COX-2的表達也明顯被誘導，并且在ALI模型鼠中，PACER的表達升高，且抑制PACER可減弱ALI小鼠的炎癥反應。這提示lncRNA PACER能通過誘導COX-2促進炎癥反應，進而密切參與ALI的發生發展，但其與ALI的具體作用及機制仍需深入研究。

綜上所述，本文在膿毒癥所致急性肺損傷患者的肺泡巨噬細胞中及LPS致ALI小鼠肺組織中PACER表達均顯著升高的基礎上，進一步觀察了PACER對ALI的影響并探討了其意義，為深入闡明lncRNA PACER在ALI中的作用與機制提供了實驗依據，并為進一步明確PACER作為ALI防治的靶標奠定了實驗基礎。