白藜蘆醇誘導小細胞肺癌H446細胞凋亡機制的研究

李王平 馬李杰 潘 蕾 金發光

白藜蘆醇是廣泛存在于自然界的一種多酚類化合物，具有很強的生物活性[1-4]。多項研究發現，白藜蘆醇對多種惡性腫瘤細胞均有明顯的抑制作用，主要機制為抑制蛋白質-酪氨酸激酶的活性、抑制癌細胞增殖，誘導癌細胞分化、凋亡等[5-8]。小細胞肺癌惡性程度高，倍增時間短，轉移早而廣泛，雖然對化療、放療敏感，初治緩解率高，但極易發生繼發性耐藥，容易復發，截止目前，小細胞肺癌的治療方法仍以放化療為主。小細胞肺癌的治療效果在過去的幾十年中沒有明顯改善，對于小細胞肺癌靶向治療及免疫治療的相關研究較為滯后[9-13]。雖然已有一些針對小細胞肺癌靶向治療的臨床實驗，但目前尚未有明確的療效報道，部分患者使用免疫調節劑，但療效欠佳[14-15]。本文擬探討白藜蘆醇對人小細胞肺癌H446細胞增殖的抑制作用及誘導H446細胞凋亡的作用及可能的機制，旨在為小細胞肺癌化療治療提供理論基礎。

材料和方法

一、實驗材料

人小細胞肺癌H446細胞由第四軍醫大學唐都醫院呼吸內科實驗室提供。FBS培養基、RPMI1640培養基、RPMI1640培養基購自美國Hyclone公司，MTT、白藜蘆醇購自Sigma 公司，DMSO 購自Invitrogen 公司，胎牛血清、胰蛋白酶購自Gibco公司，AV/PI染料購自碧云天生物技術公司，Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(BD)。主要儀器設備：細胞培養箱(美國熱電公司)，光學顯微鏡、倒置拍攝顯微鏡(蔡司公司)，低速離心機(湘儀)，酶標檢測儀(賽默飛)，流式細胞儀(BD)，DHE熒光探針(碧云天生物技術公司)，JC-10膜電位探針(ab112133)。

二、研究方法

1. 細胞培養： 觀察細胞生長情況，進行傳代擴增。觀察細胞狀態良好，細胞生長密度80%～90%，可以進行傳代；將培養皿中原有培養液棄去，用PBS洗2次； 加入0.25%的胰酶消化細胞，在顯微鏡下觀察細胞消化情況，待細胞變圓后吸去胰酶； 加入完全培養基終止消化，將細胞吹打為單細胞懸液；將細胞按照一定比例進行分離，加入適量的完全培養液培養，37 ℃，5% CO2培養箱中；每天觀察細胞狀態，擴增到足夠的細胞量后開始實驗，一般2 d可傳一代。

2. MTT檢測

(1)白藜蘆醇的細胞毒性觀察及實驗濃度篩選： 將處于對數生長期時的細胞，以5×104cells/ml密度接種到96孔細胞培養板，每孔150 μl，每個濃度梯度3個復孔，37 ℃，5% CO2培養；將白藜蘆醇分別用完全培養基稀釋至20 μg/ml，30 μg/ml，40 μg/ml，50 μg/ml，60 μg/ml，70 μg/ml，80 μg/ml，90 μg/ml，100 μg/ml，110 μg/ml和120 μg/ml按照實驗分組給藥處理，以CK、DMSO作為對照；培養24 h后在每孔加入15 μl的MTT，37 ℃，5% CO2培養箱內避光孵育3～4 h；棄上清，加入200 μl的DMSO，室溫搖床震蕩10 min；酶標儀492 nm波長測出同一時間點OD值，用測得的OD值進行細胞增殖影響的分析。

(2) 根據前期濃度篩選結果進一步觀察白藜蘆醇的細胞毒性作用特點： 將處于對數生長期時的細胞，以5×104cells/ml密度接種到96孔細胞培養板，每孔150 μl，每個濃度梯度3個復孔，37 ℃，5% CO2培養；實驗分組1：將白藜蘆醇分別用完全培養基稀釋至20 μg/ml，30 μg/ml，40 μg/ml，給藥處理，設空白對照，孵育24 h；實驗分組2：將白藜蘆醇用完全培養基稀釋至30 μg/ml，給藥處理，分別培養12 h，24 h和48 h，設空白對照；每孔加入15 μl的MTT，37 ℃，5% CO2培養箱內避光孵育3～4 h；棄上清，加入200 μl的DMSO，室溫搖床震蕩10 min；酶標儀492 nm波長測出同一時間點OD值，用測得的OD值進行細胞增殖影響的分析。

3. 流式檢測細胞凋亡、細胞內ROS及線粒體膜電位： 取對數生長期細胞，以細胞密度為1×105個/ml接種于6孔板中，每孔3 ml，于37 ℃，5% CO2培養箱中培養；實驗分組1：將白藜蘆醇分別用完全培養基稀釋至20 μg/ml，30 μg/ml，40 μg/ml，設空白對照，給藥處理24 h；實驗分組2：將白藜蘆醇用完全培養基稀釋至30 μg/ml，給藥處理，分別培養12 h，24 h和48 h，設空白對照；實驗分組：分別用不含EDTA的胰酶消化收集細胞后，以離心半徑8 cm，1 500 r/min離心5 min，然后收集細胞；用預冷的1×PBS(4 ℃)重懸細胞，以離心半徑8 cm，1 500 r/min離心5 min，洗滌細胞，然后加入300 μl的1×Binding Buffer懸浮細胞；加入5 μl的Annexin V-FITC并混勻，避光室溫孵育15 min。加入10 μl的PI染色，混勻細胞，繼續避光孵育10 min；用PBS重懸細胞，上流式細胞儀檢測。

4. 流式檢測ROS： 取對數生長期細胞，以細胞密度為1×105個/ml接種于6孔板中，每孔3 ml，于37 ℃，5% CO2培養箱中培養；實驗分組1：將白藜蘆醇分別用完全培養基稀釋至20 μg/ml，30 μg/ml，40 μg/ml，設空白對照，給藥處理24 h；實驗分組2：將白藜蘆醇用完全培養基稀釋至30 μg/ml，給藥處理，分別培養3、6、12、24 h，設空白對照；分別用胰酶消化收集以上各實驗組細胞后，以離心半徑8 cm，1 500 r/min離心5 min；用PBS清洗細胞，加入DHE熒光染料，37 ℃下避光孵育30 min；PBS重懸細胞后上流式細胞儀進行ROS檢測。

5. 流式檢測線粒體膜電位： 取對數生長期細胞，以細胞密度為1×105個/ml接種于6孔板中，每孔3 ml，于37 ℃，5% CO2培養箱中培養；實驗分組1：將白藜蘆醇分別用完全培養基稀釋至20 μg/ml，30 μg/ml，40 μg/ml，設空白對照，給藥處理24 h；實驗分組2：將白藜蘆醇用完全培養基稀釋至30 μg/ml，給藥處理。分別培養3、6、12、24 h，設空白對照；用胰酶消化收集以上各實驗組細胞后，以離心半徑8 cm，1 500 r/min離心5 min；用PBS清洗細胞，加入JC-10熒光染料，37 ℃避光孵育45 min；PBS重懸細胞后上流式細胞儀進行JC-10檢測。

三、統計學方法

結 果

一、白藜蘆醇對H446細胞的毒性觀察及MTT檢測結果

1. 白藜蘆醇作用于H446細胞后形態學變化： 白藜蘆醇給藥后，觀察發現不同濃度的白藜蘆醇可造成不同比例的細胞死亡，隨著藥物濃度增加，細胞死亡增多。細胞死亡后，出現細胞圓縮，失去原有形態，細胞不貼壁。在光鏡下(100×)可以觀察到細胞變得不透亮，失去活性，隨著濃度增加，異常細胞明顯增多。而對照組細胞形態正常，表現為細胞形態展開，細胞透亮，細胞狀態良好，細胞活性高，見圖1。

2. MTT檢測不同濃度白藜蘆醇對H446細胞增殖的抑制作用： MTT檢測發現，白藜蘆醇從30 μg/ml濃度開始，H446細胞增殖出現明顯抑制，40 μg/ml時細胞抑制率迅速上升，且隨著給藥濃度增加，其抑制率增加，到達一定濃度后其細胞抑制率不再上升，與對照組相比差異均有統計學意義，P<0.01，見圖2。

圖2 不同濃度白藜蘆醇對H446細胞的抑制率

3. 白藜蘆醇對H446細胞增殖抑制作用的特點觀察

(1)白藜蘆醇不同濃度下及作用不同時間后細胞形態變化：從形態學變化可以看出，隨著白藜蘆醇濃度增加和白藜蘆醇作用時間的延長，受損細胞數增多，受損程度變重，光鏡下可觀察到細胞形態不貼壁，圓縮，透亮度變低，異常細胞數目隨著作用濃度和作用時間的增加而增多，見圖3、4。

(2)MTT檢測白藜蘆醇不同濃度下及作用不同時間后對H446細胞增殖的抑制作用： 實驗結果表明，與CK相比較，Res在30 μg/ml時開始產生細胞抑制，40 μg/ml時其抑制率顯著上升，差異有統計學意義(P<0.01)，說明Res的細胞毒性作用有濃度依賴的特點；而作用不同時間細胞抑制率結果顯示，隨著作用時間的延長，細胞抑制率增加，在作用24 h時產生明顯抑制，作用48 h時抑制率接近70 %，差異有統計學意義，P<0.01，說明Res的細胞抑制有時間依賴的特點，見圖5。

圖1 白藜蘆醇作用于H446細胞后的形態學變化(100×)；注：A：100～120 μg/ml濃度，細胞完全死亡；B：70～90 μg/ml濃度，大部分細胞出現圓縮，失去原有形態，細胞不貼壁；C：40～60 μg/ml濃度，50%以上細胞不透亮，失去活性；D：20～30 μg/ml大部分細胞狀態良好，CK組細胞形態展開，透亮，細胞狀態良好，活性高；E：DSMO組大部分細胞狀態良好

圖3 不同濃度白藜蘆醇作用時細胞形態變化(100×)

圖4 30 μg/ml白藜蘆醇作用不同時間后細胞形態變化(100×)

圖5 不同濃度白藜蘆醇及作用不同時間(30 μg/ml)細胞抑制率

二、流式檢測細胞凋亡

1. 不同濃度白藜蘆醇作用后H446細胞凋亡變化： 流式檢測結果顯示，與CK組相比，不同濃度白藜蘆醇誘導的細胞凋亡程度不同，隨著白藜蘆醇給藥濃度的增加，細胞凋亡數量顯著增加，在40 μg/ml時凋亡比例增加顯著，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖6、7。

圖6 不同濃度白藜蘆醇流式檢測的細胞凋亡變化

圖7 不同濃度白藜蘆醇致H446細胞凋亡率

凋亡檢測結果說明白藜蘆醇誘導的細胞凋亡與濃度相關，具有濃度依賴性的特點。

2. 白藜蘆醇作用不同時間H446細胞凋亡變化： 流式檢測結果發現，與CK組相比，給藥時間不同，導致的細胞凋亡程度不同。作用24 h后，細胞凋亡比例顯著上升，作用48 h后凋亡比例超過50%，說明隨著給藥時間的延長，細胞凋亡數量增多，凋亡率增加，Res的促細胞凋亡作用有時間依賴性特點，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖8、9。

三、流式細胞儀檢測ROS

1. 不同濃度白藜蘆醇作用后細胞內ROS釋放變化： 流式細胞儀熒光測量結果顯示，隨著白藜蘆醇濃度增加，細胞內ROS釋放增多。40 μg/ml 濃度時ROS釋放量顯著增多，說明ROS釋放有濃度依賴性，差異有統計學意義，(P<0.01)，見圖10、11。

圖8 30 μg/ml白藜蘆醇作用不同時間流式檢測的細胞凋亡變化

圖9 30 μg/ml 白藜蘆醇作用不同時間H446細胞凋亡率

圖10 不同濃度白藜蘆醇給藥時細胞內ROS釋放情況

圖11 不同濃度白藜蘆醇給藥時細胞內ROS釋放量

2. 白藜蘆醇給藥不同時間細胞內ROS釋放變化： 由流式檢測結果可以看出，在Res給藥后細胞內ROS逐漸釋放，隨著白藜蘆醇給藥時間延長，細胞內ROS釋放量逐漸增多，細胞ROS釋放有時間依賴性，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖12、13。

圖12 30 μg/ml 白藜蘆醇給藥不同時間細胞內ROS釋放情況

圖13 30 μg/ml白藜蘆醇給藥不同時間細胞內ROS釋放量

四、流式細胞儀檢測線粒體膜電位

1. 不同濃度白藜蘆醇給藥后線粒體膜電位變化： 流式細胞儀檢測結果顯示，與CK組相比，白藜蘆醇給藥濃度不同，線粒體膜電位的下降程度也不同，隨著濃度的增加，下降程度增加，白藜蘆醇濃度40 μg/ml 時線粒體膜電位下降最為顯著，有濃度依賴的特點。即隨著濃度的增加，線粒體膜電位下降增加，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖14、15。

圖14 不同濃度白藜蘆醇給藥后線粒體膜電位變化

圖15 不同濃度白藜蘆醇給藥后線粒體膜電位下降率

2. 流式細胞儀檢測白藜蘆醇作用不同時間線粒體膜電位變化： 流式結果顯示，與CK組相比，隨著白藜蘆醇給藥時間的延長，線粒體膜電位下降更加明顯，給藥24 h下降最為明顯，呈現時間依賴性，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖16、17。

討論

白藜蘆醇是一種多酚類化合物，主要來源于花生 、葡萄(紅葡萄酒)、虎杖、桑椹等植物，具有很強的生物活性，近年來因其由于具有防癌及抗癌作用備受研究關注[16]。研究顯示白藜蘆醇對眾多的腫瘤具有體外細胞毒性效應，包括骨髓瘤、淋巴瘤、乳腺癌、皮膚癌、宮頸癌、卵巢癌、胃癌、前列癌、結腸癌、肝癌、胰腺癌、甲狀腺癌等[17-19]。研究表明白藜蘆醇的抗增殖活性與刺激癌細胞凋亡有關[20-23]。有人提出，細胞凋亡的激活可能是化療藥物破壞癌細胞的一種可能機制[24]。在很多人體腫瘤中，細胞凋亡受損，說明細胞凋亡功能的破壞是正常細胞轉化為腫瘤細胞的重要因素[25]。

圖16 30 μg/ml 白藜蘆醇給藥不同時間線粒體膜電位變化

圖17 30 μg/ml 白藜蘆醇給藥不同時間線粒體膜電位下降率

本文先采用了濃度篩選的方法，即通過不同濃度的白藜蘆醇作用于H446細胞，觀察其毒性作用變化與藥物濃度之間的關系。細胞毒性研究結果提示，白藜蘆醇作用于H446細胞后，細胞形態學發生了明顯變化，而且不同的濃度造成的損傷程度不同，在細胞培養中出現了不同比例的細胞死亡。 根據濃度梯度觀察結果，選擇30 μg/ml白藜蘆醇進一步觀察其對H446細胞的毒性作用特點，觀察其毒性作用是否與作用時間有相關性。研究結果顯示，隨著白藜蘆醇作用時間的增加，受損細胞變多，受損程度變重。MTT檢測結果提示白藜蘆醇可對H446細胞增殖產生抑制，其抑制率隨濃度、時間而增加，抑制率增加的特點，表現為濃度和時間依賴，并與細胞形態學觀察結果相符。

線粒體是人體供能物質產生的最主要場所，ATP生成的任一過程受阻，氧化呼吸鏈電子功能傳遞障礙，都會導致細胞供能和組織代謝發生異常，導致機體發生異常[26]。腫瘤細胞由于其線粒體結構和功能異常，因此不能發揮正常的產能功能，其代謝會發生紊亂，繼而導致腫瘤的不斷發展[27-29]。細胞受到凋亡因素刺激后，線粒體的功能和結構都會發生異常，線粒體呼吸鏈氧化磷酸化脫偶，細胞內ROS生成增多，活性氧生成達到一定程度后可使線粒體腫脹，導致線粒體膜的通透性改變；ROS可促發和加速線粒體膜通透性轉運孔的異常開放，導致ROS生成進一步增多，形成正反饋，使線粒體膜電位下降加速至不可逆，發生細胞凋亡[30]。

本文對白藜蘆醇作用于H446細胞后，細胞凋亡、活性氧及線粒體膜電位3個指標進行了觀察，這些觀察指標與線粒體功能密切相關，并從不同濃度、不同時間來進行觀察。實驗結果表明，白藜蘆醇可誘導H446細胞凋亡，增加細胞內活性氧的生成，導致線粒體膜電位下降，且其作用具有時間依賴和濃度依賴的特點，差異有統計學意義，P<0.01。

細胞凋亡可導致線粒體功能障礙，可引起ROS生成增多，而ROS生成增多可使線粒體腫脹，線粒體腫脹后通透性增高，使得線粒體膜電位的電壓平衡不能維持，導致線粒體膜電位下降，線粒體結構破壞，功能發生異常，線粒體功能發生異常后，又可誘導細胞凋亡，因此，以上因素相互作用、相互影響，形成因果循環。本文結果顯示白藜蘆醇對H446細胞的抑制與線粒體功能障礙密切相關。這一途徑在Luo 等[31]研究中亦得到證實，該研究結果認為白藜蘆醇可通過ROS介導的DNA損傷誘導肺癌細胞早衰。另一項關于白藜蘆醇誘導人肺腺癌細胞A549的研究結論，亦認為白藜蘆醇的促細胞凋亡功能與線粒體功能障礙相關[32]。

綜述所述，白藜蘆醇對H446細胞增殖具有明顯的抑制作用，可誘導H446細胞凋亡，細胞內ROS釋放增多，并進一步導致線粒體膜電位下降，其作用效果具有濃度依賴和時間依賴的特點。白藜蘆醇可通過線粒體功能障礙途徑誘導H446細胞凋亡。