NLRP3炎癥小體在海水吸入性急性肺損傷中的表達和作用

王 虎 魯 曦 王博文 師少魁 柳松勃 金發光

一直以來，海水淹溺是日常航海、海上作業及海洋軍事行動中經常發生的意外事故，每年引起大量的人員傷亡，據國際衛生組織最新統計數據，海水淹溺在全球意外傷害中排名第三[1]。海水吸入后引起海水吸入性肺損傷(seawater drowning-induced acute lung injury, SW-ALI) ，嚴重者可發展為海水吸入性呼吸窘迫綜合征(seawater drowning-induced acute respiratory distress syndrome, SW-ARDS)[2]，患者病情危重、死亡率高[3]。同淡水淹溺相比海水吸入性肺損傷較淡水淹溺嚴重，這與海水本身高滲透壓密切相關[4-5]。實驗動物模型表明，海水吸入肺損傷后炎癥細胞大量滲入到肺泡腔及肺間質，與此同時也生成大量的炎癥因子，進一步加重了肺損傷。炎癥小體(inflammasome)是由胞漿內模式識別受體(pattern recognition receptor, PRR)參與組裝的多蛋白復合物，能夠識別病原相關分子模式 (pathogen associated molecular patterns, PAMPs) 或危險相關分子模式(damage associated molecular patterns, DAMPs)，招募和激活促炎癥蛋白酶caspase-1，活化的caspase-1切割IL-1β和IL-18的前體，產生相應的成熟細胞因子，還能誘導細胞的炎癥壞死[6]。由于能被多種類型的病原體或危險信號所激活，NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3(NOD-like receptor pyrin domain containing 3, NLRP3)小體在多種疾病過程中都發揮了關鍵作用[7]。作為炎癥反應的核心,產生大量的炎性介質[8]，引起機體發生嚴重的炎癥反應，促進多種炎癥性疾病的發生與發展，如炎癥性腸病、病毒性肝炎、類風濕性關節炎等[9-10]。在肺部疾病的多項研究中發現，哮喘、吸煙誘導的動物肺組織中均呈現與NLRP3炎癥小體正相關的細胞因子[11]，例如IL-1β和IL-18的顯著增高，其次Xinmin等[12]發現使用選擇性的caspase-1抑制劑可以阻斷吸煙刺激引起的炎癥反應增高，這些均提示了與炎癥小體的相關性。因此，這為海水吸入性肺損傷提出了一個新的研究方向。

本文通過大鼠海水吸人性急性肺損傷模型，觀察NLRP3炎性小體及其下游等炎性因子的變化，試圖闡明NLRP3炎性小體在海水吸人性急性肺損傷炎性反應中發生、發展過程中的作用及機制，為海水吸人性急性肺損傷的診治提供新的思路。

材料與方法

一、實驗材料及試劑

兔抗NLRP3購于英國Biorbyt公司，IL-1β、IL-18 ELISA試劑盒購買于美國R&D公司，反轉錄一聚合酶鏈反應(RT-PCR)反轉錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒購于美國Invitrogen公司，內參GAPDH購于美國Santa cruz公司。配方海水按照中國國家海洋局第三海洋研究所海洋生化研究室提供的我國東南沿海海水的主要成分配制：滲透壓 1 300 mmol/L，pH 8.2，比重1.05，aCl 26.518 g/L，MgCl22.447 g/L，CaCl21.141 g/L，KCl 0.725 g/L，MgSO43.305 g/L，NaHCO30.202 g/L，NaBr 0.083 g/L。

二、實驗動物及分組

本實驗采用5～7周齡清潔級健康雄性 SD 大鼠50只，體重 200～280 g，于空軍軍醫大學(第四軍醫大學)動物實驗中心購買。采用完全隨機方法將大鼠分為5組: 對照組，海水處理1 h組，海水處理3 h組，海水處理6 h組，海水處理12 h組，每組10只。我科動物房飼養，適應1周，實驗中所有操作和程序均經過空軍軍醫大學(第四軍醫大學)倫理委員會批準。

三、實驗方法及檢測指標

1. 動物模型的制備： 大鼠腹腔注射3% 戊巴比妥鈉(1.5 ml/kg)麻醉，大鼠麻醉后將其仰臥固定，在頸正中切口暴露氣管，取1 ml的注射器插入氣管，在5 min之內緩慢注入3 ml/kg 海水。大鼠迅速出現呼吸急促、耳鼻發紺，全肺滿布濕啰音，很快有粉紅色泡沫液體從口鼻流出，此時肺損傷模型復制成功。在海水吸入后相應時間點麻醉放血迅速取出肺組織。

2. 肺組織病理檢測: 取各組大鼠左肺中葉肺組織迅速放4%多聚甲醛液中固定，脫水，石蠟包埋，切片，然后用蘇木精-伊( hematoxylin-eosin, HE) 染色，光學顯微鏡觀察。

3. 肺組織濕干比(W/D) 檢測: 在相應時間點處死大鼠，迅速取出各大鼠左肺中葉肺組織，吸干表面的液體稱取重量即為濕重。肺組織置于70 ℃ 烘箱內烘烤至恒重后的重量即為干重。用濕重/干重計算所得比值即為濕干比，其表示肺水腫嚴重程度。

4. ELISA 檢測IL-1β和IL-18: 將適量肺組織加入PBS 緩沖液，剪碎并用勻漿器將肺組織冰上充分勻漿，離心收集上清液，參照 ELISA 試劑盒中的說明書的步驟測定肺組織中 IL-1β和IL-18含量的改變。

5. 肺組織中IL-1β、IL-18和NLRP3 mRNA表達的RT-PCR 檢測：收集50～100 mg肺組織塊立即加入1 ml Trizol，剪碎置于冰上充分勻漿裂解，使用紫外分光度計定量，根據結果進行反轉cDNA，-20 ℃ 保存。取適量的c DNA，加入 Tap 聚合酶，進行擴增。反應條件: 95 ℃預變性 5 min，95 ℃變性 30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸 30 s，72 ℃ 7 min，最后4 ℃保存，其中變性，退火，延伸設置 40 個循環。

6. 肺組織中Western-blot檢測NLRP3蛋白表達: 取出適量肺組織，準備好的碎冰上剪碎肺組織并加入蛋白裂解液勻漿，離心收集上清，定量，沸水煮 15 min，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉膜。將已經做好標記的膜放入封閉液中，于室溫緩慢振蕩2 h以封閉非特異性結合位點，加入1︰1 000稀釋的一抗，4 ℃ 過夜，TBST洗膜；加入堿性磷酸酶標記的羊抗兔二抗，37 ℃ 溫育 2 h，再次TBST洗滌， 將膜在暗室滴上發光液，避光保存并照相，結果做灰度掃描處理分析。

四、統計學方法

結 果

一、大鼠肺組織濕干比值(W/D)結果

肺組織濕干比值(W/D)是評價肺水腫程度的重要指標。氣管灌注海水后，海水吸入可以造成肺部明顯的水腫。在本實驗中海水吸入1 h后，肺濕干比值較空白對照組顯著升高(P<0.001)，隨著時間延長濕干比值逐漸減小，肺水腫的程度逐漸減輕，但6 h依然具有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 大鼠肺組織濕干比檢測結果；注：0H組：空白對照組；1H組：海水吸入1 h組；3H組：海水吸入3 h組；6H組：海水吸入6 h組；9H組：海水吸入9 h組；***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05vs. 0H組

二、大鼠海水吸入后肺組織病理學檢測結果

光學顯微鏡下，空白對照組HE染色結果示：肺泡結構清晰完整，肺泡腔內未見明顯的炎細胞、液體滲出及出血，肺間質無明顯的改變。對照組肺組織結構紊亂，1 h及3 h組可見結構破壞，肺泡腔被壓縮、變窄，大量肺泡萎陷，泡壁增厚、斷裂，有大量的炎性細胞、液體的滲出及紅細胞漏出，間質可見出血、水腫，尤以3 h為著。隨著時間的延長，間質水腫、肺泡滲出吸收并減輕，見圖2。

圖2 大鼠肺組織病理學檢測檢測結果；注：A：對照組；B：海水吸入1 h組；C：海水吸入3 h組；D：海水吸入6 h組(HE×40)

三、海水吸入對大鼠肺組織IL-1β和IL-18的影響

ELISA法檢測，大鼠組織中IL-1β(a)和IL-18 (b)的水平隨著時間增加逐漸升高，且在3～6 h達到頂峰，隨后炎癥因子的表達逐漸降低。與空白對照組比較，海水吸入組組織中IL-1β、IL-18含量均明顯升高，差異均有統計學意義(均P<0.05)，見圖3。

圖3 大鼠組織中 IL-1β 和 IL-18 的表達水平；注：0H組：空白對照組；1H組：海水吸入1 h組；3H組：海水吸入3 h組；6H組：海水吸入6 h組；9H組：海水吸入9 h組；***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05vs. 0H組

四、海水吸入對大鼠肺組織IL-1β和IL-18 mRNA表達的影響

RT-PCR法檢測，大鼠肺組織中IL-1β(a)和IL-18 (b)的mRNA的表達水平隨著時間增加逐漸升高，且在3～6 h達到頂峰，隨后炎癥因子的表達逐漸降低，且與大鼠肺組織中IL-1β和IL-18的表達基本一致。與空白對照組比較，海水吸入組血清中IL-1β、IL-18mRNA的表達水平均明顯升高，差異均有統計學意義(均P<0.05)，見圖4。

五、海水吸入對肺組織 NLRP3mRNA表達情況的影響

采用RT-PCR法檢測肺組織中NLRP3的mRNA含量變化，結果顯示海水吸入刺激后肺組織中NLRP3的mRNA含量隨著時間明顯逐漸增加，(均P<0.05)，見圖5。

圖4 大鼠組織中IL-1β和IL-18 mRNA的表達水平；注：0H組：空白對照組；1H組：海水吸入1 h組；3H組：海水吸入3 h組；6H組：海水吸入6 h組；9H組：海水吸入9 h組；**P<0.01，*P<0.05vs. 0H組

圖5 大鼠肺組織中NLRP3mRNA的表達水平；注：**P<0.01，*P<0.05vs. 0 H組

六、海水吸入對大鼠肺組織中NLRP3蛋白含量表達情況的影響

采用Western Blot方法檢測大鼠肺組織勻漿中NLRP3蛋白含量變化，結果顯示海水吸入刺激后肺組織中NLRP3含量隨著時間明顯逐漸增加，(均P<0.05)，見圖6。

圖6 大鼠肺組織中NLRP3蛋白檢測結果；注：**P<0.01，*P<0.05vs. 0 H組

討論

海水吸入后可導致急性肺損傷，海水中電解質Na+、K+、Cl-等濃度均明顯不同于淡水和體液，在肺組織中形成高滲梯度，使大量液體外滲引起嚴重的肺水腫[13-14]，同時高滲刺激作用于細胞，對細胞產生影響，形成海水吸入特有的病理生理改變[15]。然而目前對海水吸入性肺損傷發病機制及臨床治療方法仍不明確，因此進一步探討其發病機制，尋求更加可靠有效的救治方案，為臨床治療提供參考，以挽救更多患者的生命，意義重大。

海水吸入性肺損傷中主要的病理變化為肺水腫和炎癥反應，失調的炎癥反應是導致肺損傷發生、發展的最為重要的因素之一：包括各種細胞因子的過表達，中性粒細胞溢出和活化，MAPK，NF-κB和P38等途徑的激活等[16]，而炎癥反應的上游調節途徑卻涉及甚少。我們推測，在海水吸入后可能存在著高滲刺激誘發的上游炎癥通路調節，如果適時恰當地干預這些炎癥調節相關通路的某些重要環節，可能對減輕海水吸入性肺損傷有積極的預防和治療作用。

炎癥小體(inflammasome)包含三種蛋白,分別是感受器NLRP3、接頭蛋白ASC和效應分子半胱天冬蛋白酶前體pro-caspase-1組成的高分子蛋白復合體。其主要分布于嗜中性粒細胞、單核巨噬細胞等細胞質及細胞膜中[17]。

通常，NLRP3炎癥小體處于非激活狀態，在病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular pattern, PAMPs)和損傷相關分子模式(damage-associated molecular pattern, DAMPs)下，識別細胞外源性危險信號(細菌、真菌、病毒及微生物等成分)以及內源性危險信號(包括石棉、明礬、膽固醇、二氧化硅、尿酸鹽結晶、組織或細胞損傷壞死后釋放的活性氧自由基(ROS)、壞死產物、ATP等)[18]，內外源性危險信號作用于靶細胞，可將其激活，迅速識別，誘導激活NLRP3炎癥小體[19]。NLRP3通過PYD-PYD相互作用并招募ASC，然后通過CARD作用前體caspase-1酶，切割形成成熟的caspase-1，再切割IL-1β和IL-18的前體，產生相應成熟細胞因子并分泌到細胞外[20]。這些具有活性的IL-1β和IL-18等促炎細胞因子，除引起炎性反應外，同時還作用于其它細胞因子并引起激活，導致多種效應細胞因子如IL-6、IL-8、TNF等釋放、活化及單核細胞、淋巴細胞、嗜中性粒細胞的激活，引發放大炎癥反應形成炎癥瀑布效應，進而過度的炎癥反應加重急性肺損傷，甚至引起ARDS[21-22]。

自從炎癥小體(inflammasome)被發現以來，對其研究較多，在許多疾病的發生發展過程中都發揮了關鍵作用[23]。在NLRP3炎癥小體參與下，產生大量的炎性介質,引起機體炎癥反應,促使多種炎癥性疾病的發生與發展[24]，如：哮喘、COPD、吸煙誘導的動物肺組織中均發現與NLRP3炎癥小體正相關的細胞因子IL-1β和IL-18的顯著增高, 給予caspase-1抑制劑可以明顯阻斷炎癥反應的增高[25]。

本實驗發現，海水吸入后，HE染色可見肺組織中大量炎性細胞浸潤、水腫、滲出。肺水腫較對照組更為嚴重，以1 h最為明顯，而NLRP3炎癥小體及下游炎癥因子含量3～6 h也最為明顯，后逐漸降低。RT-PCR和Western blot檢測證實NLRP3炎癥小體在肺組織中表達明顯升高，同時IL-1β和IL-18作為NLRP3炎癥小體的下游產物亦明顯升高。這些均提示NLRP3炎癥小體可能參與了海水吸入性急性肺損傷，并且可能是引起瀑布式的炎癥反應加重急性肺損傷的因素。

綜上所述，NLRP3炎性小體參與了海水誘導的急性肺損傷的炎癥反應，促進其下游炎癥因子IL-1β和IL-18的表達和釋放，加重了肺損傷的程度，但其確切的作用機制有待進一步的研究證實。