食管癌患者外周血CD3+T細胞分泌細胞因子的水平變化及其臨床意義

袁曉紅，李 鵬，李雨微

(1.西安交通大學第二附屬醫院檢驗科，西安 710014；2.西安交通大學第一附屬醫院檢驗科，西安 710061；3.西北婦女兒童醫院醫學遺傳中心，西安 710061)

食管癌是當前臨床上常見的一種疾病，隨著經濟發展和生活方式改變，其發病率不斷升高。報道表明，食管癌的發病群體主要為中年群體，并且男性發病率高于女性群體[1]。我國是世界上食管癌發病率較高的國家之一，大約每年有15萬人死于食管癌。食管癌的臨床癥狀主要為下咽困難，給患者日常生活帶來了極大不便。因此，應探討更有效的治療方法，改善患者病情。研究表明，食管癌與患者外周血CD3+T細胞分泌細胞因子水平變化存在相關性，腫瘤能夠對可溶性免疫抑制因子進行表達，并對患者的局部免疫起到抑制作用[3]。T細胞分泌細胞因子是較為常見的調節性因子，對患者自身反應性T細胞存在抑制作用，對免疫能力起到了提升作用[4]。本文探討食管癌患者外周血CD3+T細胞分泌細胞因子的水平變化，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年1月至2018年1月在西安交通大學第二附屬醫院接受治療的28例食管癌患者。納入標準[5]:(1)通過對患者進行病理診斷，確診為食管癌；并應用由美國癌癥聯合會(AJCC)和國際抗癌聯盟(UICC)聯合制定訂的惡性腫瘤TNM分期標準對腫瘤進行分期， 0期和ⅠA期為早期，ⅠB～Ⅲ期為進展期，Ⅳ期為食管癌晚期；(2)患者在用藥后，沒有取得明顯的效果。排除標準[6]:(1)不愿參與這次研究或臨床數據不完善的患者；(2)排除伴有精神疾病的患者；(3)排除多源性腫瘤患者；(4)排除接受化療治療的患者；(5)排除自身免疫障礙患者。食管癌患者為研究組(n=28)，男14例，女14例，年齡56～75歲，平均(61.3±4.2)歲，住院時間12～20 d，平均住院時間(14.3±3.1)d，TNM分期，Ⅰ期患者2例，Ⅱ期患者15例，Ⅲ期患者11例；納入同期本院健康體檢者28例為對照組，男15例，女13例，年齡54～73歲，平均(63.4±4.1)歲。本研究已經得到患者同意，一般資料差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。經過醫院倫理委員會批準。

1.2方法 首先，在手術前1 d和手術第3天,采集患者的空腹靜脈血2 mL，加 5 mL洗滌劑洗滌,離心(1 200 r/min×10 min),倒去上清液,以500 μL洗滌劑懸浮細胞液。取100 μL細胞懸液,加20 μL抗細胞表面抗原的抗 CD3-FITC,渦旋混勻,室溫暗處孵育20 min。然后對細胞進行打孔，加1.5 mL打孔液,離心(1 000 r/min×5 min)。倒去上清液,以100 μL打孔液懸浮細胞。對細胞因子進行染色：在一管內加8 μL抗細胞因子的單克隆抗體,并另設一管加10 μL該單克隆抗體的同型抗體。將其放置在4 ℃暗處進行孵育大約20 min。加其加入1.5 mL打孔液,對其進行離心(1 000 r/min×5 min)。采用流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司，型號：IMMAGE免疫分析儀)和熒光直接標記對患者外周血T細胞分泌細胞因子進行標記[7]。將使用熒光直接標記的18 μL單克隆抗體放置到90 μL的抗凝的外周血，并在室溫下對其進行孵育大約20 min，并將其加入紅細胞裂解液，進行孵育大約20 min，并對其進行洗滌[8]。最后，使用流式細胞儀對其進行相關檢測，對檢測數據進行相關分析[8]。

1.3觀察指標 (1)比較兩組外周血T淋巴細胞與正常值。使用流式細胞儀對患者抗體進行標記，并對CD3+進行檢測，然后對CD4+/CD8+、CD3+/CD8+、CD3+/CD4+進行相應的計算。(2)比較兩組外周血CD3+T細胞分泌因子IL-2、IL-4、IL-10、IL-12表達水平。(3)比較兩組外周血CD3+T細胞分泌因子腫瘤壞死因子(TNF)-α和干擾素(IFN)-γ表達水平[9]，采集患者靜脈血3 mL，將其靜置，分離取得上層血清，應用酶聯檢測試劑盒，使用ELISA方法對TNF-α和IFN-γ細胞因子進行檢測。

2 結 果

2.1兩組外周血T細胞值比較 研究組CD3+/CD4+、CD4+/CD8+表達水平低于對照組，研究組CD3+/CD8+、CD3+表達水平高于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組外周血T細胞與正常值比較

2.2兩組IL-2、IL-10、IL-12表達水平比較 研究組IL-2、IL-10、IL-12表達水平低于對照組，研究組IL-4表達水平高于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)，具體見表2。

表2 兩組外周血CD3+T細胞分泌因子表達

2.3兩組TNF-α和IFN-γ表達水平比較 研究組TNF-α表達水平高于對照組，研究組IFN-γ表達水平低于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)，具體見表3。

表3 兩組TNF-α和IFN-γ表達水平比較

3 討 論

相關報道表明，我國是食管癌發病率較高的國家之一。因此，患者出現相應的癥狀時，應及時進行診斷，避免延誤患者的最佳治療時機。同時，還應加強對疾病的防治，制定合理的生活計劃。引起食管癌的原因較多，主要分為化學病因、生物性病因、缺乏某些微量元素和生活習慣等[10]。當前，對于食管癌的治療主要采取藥物、手術、化療和放療的方法。盡管上述方法已經被廣泛運用，但是目前對患者的治療效果仍十分有限，因此，當前的首要任務是提高對患者的治療效果，保證患者的生活質量[11]。細胞免疫是患者機體抗腫瘤免疫功能的重要組成部分，由T淋巴細胞為細胞免疫進行介質的傳遞，T淋巴細胞能夠進行有效的分化，主要分化為細胞毒性和輔助性T淋巴細胞[12]。

而調節性T細胞對免疫細胞功能的負調控細胞存在較好的抑制作用，對患者機體的抗腫瘤免疫反應起到明顯的抑制作用[13]。通過對食管癌患者外周血CD3+T細胞分泌細胞因子的水平變化及其臨床意義進行探討，Th1細胞分泌INF-r、TNF-α和IL-2細胞因子,主要介導遲發型超敏反應和細胞免疫反應，Th1細胞分泌IL-10和IL-4細胞因子,對患者體液免疫反應進行介導[14]。健康患者,Th1/Th2是一種較為平衡的狀態[15]。在本次研究中，應用流式細胞術對患者T細胞因子IL-2,IL-12,IFN-r,TNF-α、IL-4和IL-10進行檢測,發現研究組CD3+/CD8+、CD3+表達水平低于對照組，說明患者此細胞因子反應模式較弱。同時，研究組TNF-α表達水平高于對照組，TNF-α表達水平升高沒有達到有效的抗腫瘤作用，主要原因為TNF-α僅是患者機體進行免疫反應的一個或某個環節。當患者的免疫功能受損，TNF-α的抗腫瘤效應不能有效作用。

研究結果顯示，研究組CD3+/CD8+、CD3+表達水平低于對照組，研究組CD4+/CD8+、CD3+/CD4+表達水平高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。這一結果充分表明了，食管癌患者外周血CD3+T細胞分泌細胞因子升高，患者的免疫力出現較為明顯的降低。同時研究結果說明，對患者外周血CD3+T細胞分泌細胞因子進行流式細胞技術檢測，不僅特異度和靈敏度高，同時對患者細胞免疫功能進行有效體現，是患者病情進展和免疫狀態的標志物。如果患者機體CD4+細胞能夠合理地減少或消失，則可改變其對患者腫瘤細胞的免疫無應答性，使得患者非特異性和特異性效應細胞自然發育，對患者抗腫瘤免疫進行有效激活。研究組IL-2、IL-10、IL-12表達水平低于對照組，研究組IL-4表達水平高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。研究組TNF-α表達水平高于對照組，研究組IFN-γ表達水平低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。這一結果充分表明了，對食管癌患者外周分泌細胞因子水平進行合理的分析，能夠增進對患者發病機制和免疫調節機制的了解，并為患者的治療提供有效的治療依據，有利于患者疾病的治療，提高患者生活質量。對于食管癌患者，食管癌患者外周血CD3+T細胞分泌細胞因子CD4+/CD8+、CD3+/CD4+表達水平顯著增高，說明患者的免疫耐受力與免疫逃逸存在較明顯的關系。