MicroRNA異常表達譜與前列腺癌的關系

李 琦 綜述，徐 佳，溫 雪，尚曉泓 審校

(中國中醫科學院西苑醫院檢驗科，北京 100091)

前列腺癌是最常見的癌癥，也是美國男性癌癥中導致死亡的第二大原因。在中國，隨著壽命的延長、環境的改變和診斷技術的改進，前列腺癌的發病率逐漸升高，目前，前列腺癌已成為國內泌尿生殖系統的首要癌癥[1]。傳統上對前列腺癌的研究集中于影響蛋白質組的基因組和表觀遺傳學的改變，但在過去10年中，越來越多的研究證明前列腺癌的發生依賴于大量非編碼RNA的改變[2]。

微小RNA(miRNAs)是一類較小的(20～25個核苷酸)進化保守的非編碼RNA，通過序列依賴的識別機制對轉錄水平進行調控[3]。miRNAs在細胞生物學過程的調控中發揮著關鍵作用[4]，參與了包括前列腺癌在內的各種人類惡性腫瘤的發生和進展[5]。miRNAs作為前列腺癌生物標志物的潛在效用引起了人們越來越多的關注，本文主要介紹近幾年發現的對前列腺癌發生和發展有貢獻的miRNAs及其靶點，包括其在細胞增殖、轉移和侵襲、細胞周期和凋亡、上皮-間質轉化(EMT)、前列腺癌腫瘤干細胞(PCSC)等中的作用及機制。

1 影響前列腺癌細胞的增殖、轉移和侵襲

近幾年，miRNA在腫瘤中的生物學意義作用方面引起了人們的廣泛關注，目前已有大量實驗證明，miRNAs對前列腺腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲具有抑制或促進作用。

CHI等[6]收集了20位前列腺癌患者的腫瘤組織和腫瘤鄰近組織，對腫瘤蛋白D52(TPD52L2)和microRNA-503(miR-503)分子之間的相互作用進行預測，并分別用陰性對照、miR-503模擬物、miR-503抑制劑轉染DU145細胞，采用RT-RNA和Western blot法檢測miR-503和TPD52L2 mRNA的水平及TPD52L2蛋白的表達水平，用Transwell和MTT分析前列腺細胞的遷移和增殖能力，以此來探討miR-503在前列腺癌細胞中的表達及其對前列腺癌的作用和作用機制。結果發現前列腺癌組織中TPD52L2表達增加而miR-503表達降低；TargetScan將TPD52L2的3′非翻譯區(3′UTR)鑒定為miR-503的直接靶標；與空白組和陰性對照組相比，轉染miR-503模擬物的DU145細胞中miR-503的表達顯著增加，TPD52L2 mRNA和蛋白水平顯著降低，遷移細胞數量顯著減少，吸光度顯著降低，這些結果表明miR-503的過表達抑制了TPD52L2的轉錄翻譯和DU145細胞的遷移和增殖能力。

GUAN等[7]發現去勢抵抗性前列腺癌(CRPC)組織比雄激素依賴性前列腺癌(ADPC)組織miR-744的表達水平更高，且CRPC細胞(DU145和PC3細胞株)和雄激素非依賴性前列腺癌(AIPC)細胞(LNCaP-AI)中miR-744表達水平顯著高于ADPC細胞(LNCaP)，并且miR-744的表達水平與CRPC患者的生存呈負相關。該研究將抗miR-744寡核苷酸或抗NC寡核苷酸、miR-NC、miR-744模擬物轉染到PC3、Du145和LNCaP-AI細胞中，通過分析發現與抗NC寡核苷酸相比，抗miR-744寡核苷酸明顯抑制PC3，DU145和LNCaP-AI細胞的增殖、遷移和侵襲；相應地，與miR-NC轉染相比，miR-744模擬物的過表達顯著增強了LNCaP細胞的增殖、遷移和侵襲。通過基因表達陣列，途徑富集分析和Western blot，進一步發現miR-744通過靶向作用于Wnt/β-catenin信號傳導的多個負調節物(包括SFRP1、GSK3β、TLE3和NKD1)顯著激活Wnt/β-catenin途徑。在分子水平上，發現 NKD1是miR-744的主要功能靶標。因此，該研究表明miR-744可能通過Wnt/β-catenin信號通路促進前列腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。

ZHANG等[8]比較了LNCaP、DU145、PC-3和RWPE-1細胞系中miR-30c的表達水平并研究了miR-30c的過表達對細胞增殖、遷移和侵襲的影響以及用Western blot分析了miR-30c對KRAS的影響。結果顯示與LNCaP、DU145和RWPE-1細胞系相比，PC-3細胞系中miR-30c的表達顯著降低。 miR-30c在PC-3中的過度表達抑制了腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。此外，與陰性對照組相比，miR-30c過表達細胞系中KRAS蛋白表達水平明顯下調，表明miR-30c的過表達可能導致KRAS蛋白水平下調，從而抑制前列腺癌細胞系增殖、遷移和侵襲。

2 干擾前列腺癌細胞周期和細胞凋亡

細胞增殖的快慢是由完成一個細胞周期的時間長短決定的。整個細胞周期分為G1、S、G2和M4期，而G1期則是整個細胞周期長短的關鍵。大量實驗證明miRNAs主要通過調節G0/G1細胞群和靶向調控相關基因和蛋白質的表達水平影響腫瘤細胞的細胞周期并最終誘導腫瘤細胞凋亡的。

HUANG等[9]對前列腺癌組織中選擇性剪接因子/剪接因子2(ASF/SF2)的表達水平和ASF/SF2是否為miR-30c的直接靶基因進行了研究，并用miR-30c模擬物轉染前列腺癌細胞系后檢測miR-30c對前列腺癌細胞凋亡的影響。結果發現與健康組織比較，前列腺癌組織表現出更高水平的ASF/SF2，并揭示了miR-30c與ASF/SF2基因的3′非編碼區靶向結合，從而下調ASF/SF2蛋白的表達。同時該研究還發現ASF/SF2降低引起細胞增殖的減少與細胞周期停滯相關，且miR-30c過表達的細胞中凋亡細胞的百分比顯著增加，表明 miR-30c通過下調ASF/SF2誘導前列腺癌細胞周期停滯和細胞凋亡。

COLDEN等[10]分析了miR-466對前列腺癌細胞周期和凋亡的影響。結果發現與對照miRNA相比，miR-466可誘導轉移性前列腺癌PC3和DU145細胞中G0/G1細胞周期停滯和細胞凋亡；并進一步證明miR-466通過直接靶向RUNX2并減弱其已知介導前列腺癌骨轉移的下游靶基因來部分發揮這些作用。

3 調節前列腺癌的上皮-間質轉化(EMT)

EMT是一種多步驟的變化，其中上皮細胞特征喪失并且獲得間充質表型。EMT使癌細胞具有轉移、侵襲性和干細胞的惡性特性。miRNAs通過調節EMT相關轉錄因子、上皮和間質基因或關鍵信號通路來調節EMT[11]。在前列腺癌中，報道了多種調節EMT的miRNAs，如miR-145、miR-200家族、miR-205等[12]。

漿細胞瘤變異易位1(PVT1)是一種新型長鏈非編碼RNA，已被證明在許多腫瘤細胞中上調，并且越來越多的證據表明PVT1可以調控許多癌癥相關的細胞過程[13]。CHANG等[14]采用生物信息學分析，Western blot等技術研究了PVT1在前列腺癌中的作用及其機制。該研究表明PVT1通過海綿效應作用于miRNA-186-5p并正向調節Twist1(一種與EMT相關的轉錄因子)，從而促進EMT，進而促進前列腺癌的轉移和侵襲作用。因此，PVT1/miR-186/Twist1調控軸可能是前列腺癌的一種新的治療靶點。

GURURAJAN等[15]為研究miR-154*和miR-379在前列腺癌EMT中的作用，在間充質型ARCaPM 前列腺癌細胞中引入了shRNA以產生miR-154*敲低(ARCaPM-154*i)或miR-379敲低(ARCaPM-379i)細胞，并使用scrambled shRNA產生對照shRNA載體(ARCaPM-C)。通過qRT-PCR分析發現，與ARCaPM-C相比，在ARCaPM-154*i和ARCaPM-379i細胞中檢測到miR-154*和miR-379的表達降低，并且ARCaPM-154*i細胞中STAG2的表達水平顯著增加。此外，該實驗發現對miR-154 *或miR-379進行抑制后，間充質ARCaPM細胞可逆轉為上皮表型，并伴隨ARCaPM-154 *和ARCaPM-379i細胞中上皮標志物E-鈣黏著蛋白的上調。由此可證明DLK1-DIO3簇的miR-154 *和miR-379通過下調STAG2促進前列腺癌細胞發生EMT。

WANG等[16]為驗證miR-802是否可以調節前列腺癌細胞中的EMT，通過分析評估常見的EMT標志物，發現與轉染對照miRNA的細胞比較，miR-802模擬物轉染的DU145細胞中間質細胞標志物(波形蛋白和N-鈣黏蛋白)表達水平降低；上皮細胞標志物(E-鈣黏蛋白)表達水平升高。此外，熒光素酶活性分析將Flot2鑒定為miR-802在前列腺癌細胞中的直接靶標， miR-802高表達可降低Flot2的表達水平，從而抑制前列腺癌細胞發生EMT。

4 調節前列腺癌腫瘤干細胞(CSCs)，抑制前列腺腫瘤發生

CSCs是腫瘤塊中癌癥細胞亞群的一個子集，并被認為是腫瘤發生，抗癌治療耐藥，復發和轉移的原因[17]。據報道，miRNA是調控PCSCs干細胞的關鍵因子。異常表達的miRNA可能導致與CSCs功能相關的特定信號通路失調如TGF-β、Wnt/β-連環蛋白和MAPK途徑。因此，鑒定調節CSC特性的特定miRNAs將有助于擴大對前列腺癌分子發病機制的理解，并為前列腺癌治療設計更好的策略[18]。

CHANG等[18]研究了人類前列腺癌細胞系和非致瘤性前列腺上皮細胞系中miR-7的表達水平，結果發現miR-7在前列腺癌細胞系中顯著下調。這暗示了其對前列腺癌潛在的抑制作用。該研究又進一步檢測了CD44+CD133+和CD44-CD133-亞群中干細胞因子的表達水平，以此探究CD44+CD133+亞群在前列腺癌中是否具有CSC特征及miR-7發揮作用的具體機制，結果發現CD44+CD133+細胞中干細胞因子的表達水平顯著高于CD44-CD133-亞群，miR-7的表達水平顯著低于CD44-CD133-亞群，這表明CD44+CD133+具有PCSC特性并且miR-7與PCSC的干性密切相關。此外該研究通過熒光素酶報告基因證明，miR-7通過抑制關鍵干細胞因子KLF4來消除PCSC的干細胞從而抑制前列腺腫瘤發生，并且miR-7對PCSCs干細胞的抑制作用在異種移植物中可持續數代。

JIN等[19]研究證明，通過寡核苷酸轉染的miR-128過表達可抑制體內異種移植瘤的增殖、侵襲和癌細胞克隆，并且其表達水平與前列腺癌細胞的致瘤潛力反向相關。他們進一步篩選了miR-128的潛在靶標并發現miR-128的過表達以細胞類型依賴性方式降低了包括Bmi-1、Nanog、TGFBR1和EGFR在內的前列腺癌細胞中的致癌和干細胞相關基因的表達水平：在PC3細胞中，miR-128顯著降低NANOG和TGFBR1水平；而在PPC-1細胞中miR-128降低了E2F3 mRNA水平；在DU145細胞中miR-128減弱了除EGFR外的所有分子的mRNA水平。所有這些基因都與維持腫瘤干細胞特性有關，通過熒光素酶報告基因分析發現，BMI-1為miR-128的直接靶標。這些數據表明，miR-128通過抑制BMI-1的表達而削弱PCSC特性進而抑制前列腺癌的發生。

LIU等[20]檢測了miR-1993a-3p對PCSC特性的影響，結果發現與陰性對照相比，用miR-199a-3p轉染的純化的CD44+DU145細胞、PC3和LACP9細胞中均表現出顯著降低的克隆效率，表明miR-199a-3p可能在體外抑制PCSC的自我更新，起到負向調節的作用。他們進一步證明了miR-199a-3p過表達減少了CD44+前列腺癌細胞的腫瘤起始能力及來自本體前列腺癌細胞的腫瘤再生,并發現miR-199a-3p可靶向作用于干細胞相關和促有絲分裂分子CD44、c-MYC、細胞周期蛋白D1(CCND1)和EGFR，從而抑制PCSC的擴增和致瘤能力。

5 在前列腺癌化療藥耐藥中的機制和作用

紫杉烷類(如多西他賽)已被證明在前列腺癌等腫瘤疾病中是一類具有細胞毒性的化療藥物[21]。雖然紫杉烷能提高晚期前列腺癌的存活率，但其藥物耐藥性的發展仍不可避免，患者的病情最終會發生進展，因此,只能獲得有限的治療。在前列腺癌中存在多種多西他賽耐藥機制：不利的腫瘤微環境、藥物外排泵、微觀結構和(或)功能的改變以及凋亡缺陷(如Bcl-2的上調或PTEN/PI3K/mTOR途徑的激活和MAPK/ERK途徑的激活)[22]。

WANG等[23]為研究miR-375在多西紫杉醇耐藥中的作用，使用pre-miRNA 慢病毒載體轉染miR-375，并考察了外源性過表達miR-375對兩種前列腺癌細胞株DU145和PC-3細胞生長的影響。同時，為確定過度表達的miR-375對體內腫瘤生長和化療耐藥的影響，將miR-375過度表達的前列腺癌細胞注入裸鼠皮下。結果發現miR-375在前列腺癌的增殖中發揮了雙重作用，雖然miR-375過表達導致細胞生長抑制和細胞凋亡，但miR-375升高也顯著降低了細胞對多西他賽治療的敏感性。為進一步明確耐藥機制，該研究用miR-375模擬物轉染前列腺癌細胞系，并對SEC23A和YAP1 mRNA的表達進行檢測。結果發現SEC23A和YAP1 mRNA表達顯著降低。可見miR-375通過調控SEC23A和YAP1表達，影響了對多西他賽化療耐藥性的發展。因此，miR-375或其靶基因SEC23A或YAP1可作為潛在的生物標志物用于在mCRPC階段化療和(或)治療的靶點，以克服化療耐藥性。

SHI等[24]測定了多西他賽耐藥PC3細胞中miRNAs的表達并用實時PCR技術對陣列結果進行了驗證。結果發現miR-21在PC3R細胞中上調。在PC3野生型細胞中，miR-21的異位表達增強了多西他賽的耐藥性，而在PC3R細胞中使用miR-21抑制劑使細胞miR-21沉默后導致細胞對多西他賽敏感。此外，還發現miR-21可以直接下調PDCD4的表達。PDCD4表達的沉默增加了PC3細胞的細胞活力和對多西他賽的抗性，這表明PDCD4是miR-21誘導多西他賽化學抗性的功能靶點。可見miR-21有助于PC3細胞對多西他賽的抵抗，靶向作用于miR-21可減弱前列腺癌對多西他賽的耐藥性。

長鏈非編碼RNA CASC2作為miR-183的競爭性內源RNA具有腫瘤抑制作用，而Sprouty2(SPRY2)是RTK信號的關鍵拮抗劑，也可用作腫瘤抑制劑。GAO等[25]研究發現在前列腺癌組織及細胞系中CASC2和SPRY2的表達水平均有所下調，而CASC2和SPRY2的過度表達可以達到抑制前列腺癌細胞增殖，促進前列腺癌細胞凋亡，增強前列腺癌細胞對多西他賽敏感性的效果，而miRNA-183可降低SPRY2的表達，進而部分減弱多西他賽對前列腺癌細胞的細胞毒性。通過進一步研究發現，CASC2對SPRY2的表達具有正向調控作用，CASC2可直接靶向作用于miR-183，同時結合SPRY2的3′UTR，并通過SPRY2的表達抑制其下游胞外調節蛋白激酶(ERK)信號傳導通路的激活。由此可見，CASC2與SPRY2競爭結合miR-183以拯救SPRY2在前列腺癌細胞中的表達，從而通過SPRY2下游ERK信號傳導途徑增強前列腺癌細胞對多西他賽的敏感性。

6 前列腺癌診斷、治療和預后的新型標志物

大量研究證明miRNAs在腫瘤診斷、預后和治療中具有生物標志物的潛在用途，并將其表達水平與臨床病理參數聯系起來[26]。評估miRNAs在前列腺癌細胞中的表達水平可用于前列腺癌的診斷、預后和進展監測，并且可以通過各種廣泛使用的標準技術(如qRT-PCR、微陣列和小RNA測序)輕松檢測和準確定量，同時它們可存在于體液中[27]，不需要侵入式活檢，因此，可成為前列腺癌治療選擇和判斷預后的良好標志物[28]。WASEEM等[29]使用miRNA微陣列芯片，對來自良性前列腺增生癥(BPH)和不同病理級別的前列腺癌組織樣品進行了全面的miRNA分析。該研究發現與BPH和健康對照組相比，miR-711在前列腺癌組織中顯著下調，這與微陣列和qRT-PCR的分析結果一致。他們還發現miR-711的表達與腫瘤細胞的轉移和前列腺癌的進展呈負相關，這暗示該新型miR-711在前列腺癌進展中具有腫瘤抑制作用，此外，ROC曲線分析顯示miR-711是特異度和靈敏度均較高的候選生物標志物。

WANG等[30]通過 miRNA微陣列分析比較了CRPC和ADPC差異表達的miRNA，結果發現miR-4638-5p在CRPC中表達水平顯著下調并且miR-4638-5p在早期階段比在晚期疾病中的表達高出近4.7倍。在與CRPC發育密切相關的前列腺癌干細胞的單獨miRNA微陣列分析中，與未選擇的DU145細胞群相比，miR-4638-5p是最顯著下調的miRNA，具有近12.6倍的差異。另外，他們還測定了LNCaP、PC3、DU145和LNCaP C4-2B 前列腺癌細胞系中miR-4638-5p的表達水平，結果與在臨床樣品中的觀察結果一致。因此，miR-4638-5p可能會成為前列腺癌診斷和治療的新型生物標志物。

7 結 論

前列腺癌作為男性泌尿生殖系統最常見的惡性腫瘤之一，其檢測目前主要基于血清前列腺特異性抗原生物標志物和數字直腸檢查等手段[31]。然而，這些方法可能會造成對患者過度診斷和治療的不良后果，因此，仍然需要可用于前列腺癌檢測和預后的新型生物標志物。近幾年，有關miRNA與前列腺癌關系的報道越來越多， miRNA幾乎參與前列腺癌所有關鍵的細胞過程[31]，如本文介紹的miR-503、miR-30c可抑制前列腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，而miR-744對前列腺癌細胞的增殖、轉移和侵襲起促進作用；miR-30c、miR-466可誘導前列腺癌細胞的細胞周期停滯和細胞凋亡；miR-186-5p、miR-154 *、miR-379可促進前列腺癌細胞發生上皮-間質轉化，而miR-802抑制前列腺癌細胞EMT的發生；miR-7、miR-128、miR-1993a-3p對PCSC的擴增和致瘤能力具有抑制作用；miR-375、miR-21可減弱多西他賽的化療耐藥性，而miR-183的表達則會減弱多西他賽的敏感性；miR-711、miR-4638-5p等可成為前列腺癌診斷和治療的潛在的新型生物標志物。

miRNA與前列腺癌的相關研究盡管取得顯著的進步，但仍然面臨很大挑戰。首先，miRNA通常被包裹在脂質微泡中而免于降解，這使其對RNA酶和物理化學條件有較強的抵抗力，從而可能會造成生物污染[32]。其次，各研究所使用的研究設計及分析平臺等應盡可能地減少差異，從而為臨床提供對疾病的診斷、治療及預后一致有用的信息。另外，對于miRNA與前列腺癌的相關研究多停留在研究階段，要想在臨床實踐中使用miRNA作為標志物和治療靶標，還需要更加深入的臨床研究。