老年宮頸癌患者血清NO、Gal-9表達(dá)及其與細(xì)胞凋亡的相關(guān)性研究

劉愛萍，胡 潔

(甘肅省婦幼保健院:1.臨床檢驗(yàn)中心；2.整形美容科，甘肅蘭州 730050)

宮頸癌也稱為宮頸浸潤癌，是女性常見的一種惡性腫瘤，根據(jù)近年來流行病學(xué)調(diào)查研究顯示，宮頸癌發(fā)病率近年來呈逐年上升趨勢(shì)[1]。一氧化氮(NO)是生物體內(nèi)普遍存在的一種活潑的小分子物質(zhì)，可參與信息傳遞、機(jī)體免疫應(yīng)答、血管舒張調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡等正常生理活動(dòng)[2-3]。近年來學(xué)者研究表明，NO與多種病理過程相關(guān)，尤其與腫瘤血管生成以及腫瘤細(xì)胞凋亡等有關(guān)[4]。半乳凝素家族在動(dòng)植物組織中有廣泛分布，可參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖凋亡、細(xì)胞黏附以及RNA轉(zhuǎn)錄加工等多種病理生理過程[5]。其中半乳凝素-9(Gal-9)在機(jī)體炎性反應(yīng)、腫瘤轉(zhuǎn)移、細(xì)胞生長分化等方面具有突出的影響[6]。本研究針對(duì)老年宮頸癌患者進(jìn)行分析，探討老年宮頸癌患者血清NO、Gal-9表達(dá)及其與細(xì)胞凋亡的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2015年3月至2017年6月本院收治的76例老年宮頸癌患者作為觀察對(duì)象，76例患者均經(jīng)術(shù)后病理結(jié)果確診，年齡≥60歲；排除非宮頸原發(fā)腫瘤患者、合并其他惡性腫瘤患者。宮頸癌患者年齡60～82歲，平均(69.83±6.12)歲；低分化18例(23.68%)、中分化41例(53.95%)、高分化17例(22.37%)；按照國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)病理分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期16例(21.05%)、Ⅱ期25例(32.89%)、Ⅲ期27例(35.53%)、Ⅳ期8例(10.53%)；組織病理學(xué)分型：鱗癌58例(76.32%)、腺癌18例(23.68%)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移34例(44.74%)、未轉(zhuǎn)移42例(55.26%)。

再選擇同期收治的老年子宮頸上皮不典型增生(CIN)患者50例以及老年健康人群50例作為對(duì)照。CIN組年齡60～80歲，平均(68.79±6.38)歲，其中CIN Ⅰ期28例(56.00%)、CIN Ⅱ期22例(44.00%)。健康對(duì)照組年齡60～83歲，平均(69.57±7.21)歲。3組受試者年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡指數(shù) 分別取宮頸癌組織、CIN組織以及正常宮頸組織，置于盛有PBS的小燒杯內(nèi)，使用眼科剪將其反復(fù)剪碎后過濾(160目尼龍網(wǎng)篩)，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109/L。取1 mL單細(xì)胞懸液，離心后棄去上清，加入1 mL PBS，重復(fù)離心后棄去上清。使用預(yù)冷的70%乙醇固定細(xì)胞，然后置于4 ℃冰箱內(nèi)過夜。次日離心5 min，棄去上清后使用PBS漂洗一次，加入PNase酶37 ℃作用30 min，加入50 μmg/mL碘化丙啶(PI)1 mL，4 ℃避光染色20 min，過濾，使用FCM測(cè)定。以正常人外周血淋巴細(xì)胞作為正常二倍體標(biāo)準(zhǔn)，使用CELLQUEST分析軟件計(jì)算各組細(xì)胞凋亡(AI)指數(shù)。

1.2.2血清NO、Gal-9水平檢測(cè) 采集3組受試者清晨空腹靜脈血5 mL，肝素抗凝，離心分離血清，-40 ℃保存待測(cè)。采用硝酸還原酶法檢測(cè)受試者血清NO水平，NO檢測(cè)試劑盒購于南京建成生物工程研究所；采用雙單抗夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)受試者血清Gal-9水平，Gal-9 ELISA檢測(cè)試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司。操作嚴(yán)格按照試劑盒使用說明書進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.13組細(xì)胞凋亡指數(shù)比較 3組受試者AI指數(shù)比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中宮頸癌組患者AI指數(shù)明顯高于健康對(duì)照組，但明顯低于CIN組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 受試者細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)比較

2.23組血清NO、Gal-9表達(dá)比較 3組受試者血清NO、Gal-9水平比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且宮頸癌組患者血清NO、Gal-9水平明顯高于健康對(duì)照組與CIN組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 3組受試者血清NO、Gal-9水平比較

2.3宮頸癌患者血清NO、Gal-9水平與細(xì)胞凋亡相關(guān)性分析 采用Spearman相關(guān)分析分析宮頸癌患者血清NO、Gal-9水平與AI相關(guān)性，結(jié)果顯示，宮頸癌患者血清NO水平與AI值呈正相關(guān)(r=0.813，P<0.05)；宮頸癌患者血清Gal-9與AI值呈正相關(guān)(r=0.872，P<0.05)。

2.4血清NO、Gal-9水平與老年宮頸癌患者臨床病理特征關(guān)系 宮頸癌臨床分期Ⅲ、Ⅳ期患者血清NO、Gal-9水平明顯高于Ⅰ、Ⅱ期患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，腫瘤低分化患者血清Gal-9水平明顯高于中、高分化患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余臨床病理特征對(duì)血清NO、Gal-9水平無明顯影響，見表3。

表3 血清NO、Gal-9水平與老年宮頸癌患者臨床病理特征關(guān)系

3 討 論

細(xì)胞凋亡是有核細(xì)胞在一定條件下通過自身內(nèi)部機(jī)制啟動(dòng)而發(fā)生的一種細(xì)胞自然死亡的過程，細(xì)胞凋亡是一種與有絲分裂相反的方式調(diào)節(jié)細(xì)胞群體相對(duì)穩(wěn)定的重要方式，在細(xì)胞發(fā)育、增殖、分化以及死亡過程中均發(fā)揮重要的影響作用，同時(shí)，細(xì)胞凋亡對(duì)于腫瘤的發(fā)生、抗腫瘤藥物的治療以及細(xì)胞間信息傳遞等方面同樣具有重要的作用[7-9]。本研究對(duì)健康對(duì)照組、CIN組以及宮頸癌組患者組織進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)，結(jié)果顯示，CIN患者細(xì)胞凋亡率明顯高于健康對(duì)照組，表明當(dāng)宮頸上皮細(xì)胞發(fā)生不典型增生時(shí)，細(xì)胞凋亡增加，此時(shí)仍能維持細(xì)胞增殖與死亡之間的平衡；而宮頸癌患者細(xì)胞凋亡卻較CIN患者明顯降低，表明隨著病變加重至癌變階段，細(xì)胞凋亡率降低，提示宮頸癌的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞凋亡之間有著密切的相關(guān)性，隨著疾病的進(jìn)展及細(xì)胞內(nèi)相關(guān)基因表達(dá)的變化，細(xì)胞凋亡受到抑制，導(dǎo)致宮頸上皮細(xì)胞平衡被破壞，從而引發(fā)癌變[10-11]。

NO是一種非常活潑的自由基，可對(duì)機(jī)體血管、神經(jīng)系統(tǒng)等發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，但NO濃度較高時(shí)具有一定的細(xì)胞毒性，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定的作用[12]。近年來學(xué)者報(bào)道顯示，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)在子宮頸癌、卵巢癌等多種婦科腫瘤組織中均有明顯表達(dá)上調(diào)趨勢(shì)，提示腫瘤組織局部NO生成增多[13-14]。Gal-9在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞外基質(zhì)以及細(xì)胞核內(nèi)均有分布，研究表明，Gal-9在胃腸道、肝臟及各種免疫細(xì)胞中均有高表達(dá)，同時(shí)在胃癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、前列腺癌等不同腫瘤組織中也檢測(cè)到了Gal-9表達(dá)[15-16]。本研究對(duì)比分析3組受試者血清NO、Gal-9水平，結(jié)果顯示，宮頸癌患者血清NO、Gal-9水平顯著高于CIN組及健康對(duì)照組，而CIN組患者血清NO、Gal-9水平顯著高于健康對(duì)照組，提示宮頸上皮細(xì)胞不典型增生至癌變過程中，NO以及Gal-9發(fā)揮著一定的影響作用，與相關(guān)研究報(bào)道結(jié)果相似[17]。

關(guān)于NO對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，研究顯示，NO可誘導(dǎo)肌母細(xì)胞、視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞發(fā)生凋亡，但是其對(duì)肝細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞凋亡起著抑制作用[18]。而報(bào)道顯示，Gal-9可誘導(dǎo)胸腺細(xì)胞、T細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞的凋亡，同時(shí)對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)移等發(fā)揮了一定作用[19-20]。本研究以老年宮頸癌患者作為研究對(duì)象，結(jié)果顯示，患者血清NO水平、Gal-9與老年宮頸癌細(xì)胞凋亡呈正相關(guān)，提示NO、Gal-9參與到了宮頸癌細(xì)胞凋亡過程中，且隨著患者腫瘤臨床分期的增加，NO、Gal-9水平顯著升高，表明在機(jī)體對(duì)抗腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，可能受到NO、Gal-9等多種因素的影響，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡與增殖的平衡被打破。

4 結(jié) 論

宮頸癌患者血清NO、Gal-9水平顯著高于CIN組及健康對(duì)照組，老年宮頸癌血清NO水平、Gal-9與老年宮頸癌細(xì)胞凋亡呈顯著正相關(guān)關(guān)系。血清NO、Gal-9參與到了老年宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中，同時(shí)對(duì)宮頸癌組織細(xì)胞凋亡發(fā)揮一定的影響作用，其具體影響機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究分析。