腦脊液谷胱甘肽氧化酶在阿爾茨海默病中的診斷價值

劉辰庚 孟 雙 高 原 關小童 張齊皓 朱繼開 許清源 王培昌

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一類重要的神經系統退行性變疾病，其臨床表現主要為認知功能、記憶能力、語言表達和行為方式等的漸進性、持續性退化[1]。目前AD的早期診斷大都依賴精神量表評分、臨床癥狀和影像學指標等，但能常規用于臨床AD診斷的檢驗醫學生物標志物較少[2～5]。筆者所在科室前期研究發現，AD患者腦脊液(cerebro-spinal fluid，CSF)酶譜可能有助于其診治,本研究擬初步探索其中的損傷性酶學標志物：肌酸激酶(creatine kinase，CK)和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)，以及氧化還原酶學和肽類標志物：谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)、谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase，GR)、還原性谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)和氧化性谷胱甘肽(oxidized glutathione，GSSG)等在AD早期診斷和分期中的潛在價值。

材料與方法

1.臨床資料：隨機選取2017年10月～2018年3月就診于首都醫科大學宣武醫院的AD受試者共235例，其中輕度認知障礙期受試者(mild cognitive impairment，MCI)100例(男性43例，患者平均年齡65.0±4.5歲；女性57例，患者平均年齡67.0±4.7歲)；癡呆期受試者(dementia of the Alzheimer type，DAT)135例(男性69例，平均年齡72.0±5.0歲；女性66例，平均年齡74.0±4.5歲)。MCI和DAT的診斷符合我國神經內科學會推薦的診斷標準[6, 7]。分別針對MCI和DAT組隨機選取健康對照組受試者各30例(MCI對照組：男性14例，患者平均年齡65.0±4.5歲；女性16例，患者平均年齡67.0±4.7歲。DAT對照組：男性15例，患者平均年齡69.0±5.0歲；女性15例，患者平均年齡72.0±4.5歲)。另隨機選取血管性癡呆(vascular dementia，VD)患者30例作為疾病對照組(男性15例，平均年齡59.0±4.5歲；女性15例，平均年齡64.0±4.6歲)。生物參考區間建立使用隨機選取的健康受試者(包含以上的表面健康對照組受試者)120例，男女性別各半，年齡31～80歲，平均年齡55.0±4.6歲。本研究內容已經首都醫科大學宣武醫院倫理學委員會審核批準。

2.標本留取：受試者于上午由臨床醫生抽取CSF，抽取后的樣本于1h內送至實驗室，CSF常規結果顯示紅細胞陽性的標本棄用，CSF經4000×g離心5min后取上清置于-80℃冰箱備用，標本只允許凍融1次。

3.損傷性酶學標志物檢測：使用日本日立7600型全自動生化分析儀檢測CK和LDH。CK檢測使用北京中生公司試劑，LDH檢測使用北京柏定公司試劑，檢測參數為筆者所在科室研發的CSF檢測專用參數；測定時儀器處于正常的鑒定、保養、定標和室內質控狀態。

4.氧化還原酶學標志物檢測：使用分光光度法檢測GPx、GR、GSH和GSSG；試劑由上海碧云天公司提供；儀器為上海思龍722s型分光光度計；所有檢測操作均嚴格按照說明書進行。

5.生物參考區間的初步建立：使用表面健康受試者的95% CI計算各指標的生物參考區間，比較它們在早期AD診斷和分期中的價值。

6.統計學方法：使用SPSS 21.0統計學軟件對數據進行統計分析和受試者工作曲線分析(receiver operating characteristic curve，ROC)。非正態分布計量資料的組間比較使用Mann-WhitneyU檢驗進行組間檢測結果的統計學分析；率的比較使用χ2檢驗；組間比較使用單因素方差分析(one-wayANOVA),以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.損傷性酶學標志物檢測結果：MCI受試者CSF的CK和LDH略高于健康對照組和血管性癡呆組，但差異無統計學意義(P> 0.05)；DAT受試者CSF的CK顯著高于MCI組、正常對照組和血管性癡呆組(P<0.05，表1)。

表1 損傷性酶學標志物檢測結果

與對照組比較，*P<0.05；與血管性癡呆組比較，#P<0.05；與MCI組比較，ΔP<0.05

2.氧化還原酶學標志物檢測結果：MCI受試者CSF的GR水平顯著低于健康對照組和血管性癡呆組(P<0.05)，其GPx和GSH略低于健康對照組但差異無統計學意義(P>0.05)。DAT患者的GR水平顯著低于健康對照組、血管性癡呆組和MCI組(P<0.05)，其GPx和GSH顯著低于健康對照組、血管性癡呆組和MCI組(P<0.05,表2)。

表2 氧化還原酶學標志物檢測結果

3.診斷效能比較：使用健康受試者測定值計算的各指標95%生物參考區間和使用ROC曲線分析得出的MCI和DAT患者的診斷界值、敏感度和特異性見表3，各項目的生物參考區間上限均低于ROC曲線確定的截斷值。CK和GR在MCI和DAT的診斷和鑒別診斷中具有較高的敏感度和特異性(P<0.05)。

表3 各指標的生物參考區間和ROC曲線分析各指標對MCI及DAT的診斷效能

討 論

據世界衛生組織(World Health Organization，WHO)統計，全世界目前約有3500萬AD患者。隨著我國人口老齡化的不斷演進，近年來AD的患病人數呈不斷增長的態勢[7～9]。研究表明，在患者出現典型的AD臨床癥狀之前的10～20年，其腦組織中已存在了AD相關的病理生理改變，且持續至發病[10～12]。但對于已經確診的癡呆期AD患者(DAT)而言，目前尚缺乏有效的治療手段[13, 14]。而對于MCI和MCI前期等早期AD患者則可通過藥物干預和生物物理治療等手段有效緩解疾病的進展。故在當前階段，對其AD進行有效的早期診斷和病程監控更為關鍵[15, 16]。

目前可用于AD診斷的生物標志物主要有核酸類和蛋白類兩種，核酸類標志物主要集中在易感基因分析和microRNA等小分子核酸檢測方面，蛋白類標志物主要包括tau蛋白和Aβ等AD關鍵蛋白的檢測方面[17]。上述標志物主要存在檢測方法復雜、不適于早期診斷、檢測周期長、結果不穩定等問題。而酶學標志物的檢測方法成熟，檢測速度快，檢測結果準確，故在多種疾病的診斷中有廣泛的應用[18]。本研究結合前期研究，檢測了不同階段AD患者CSF內的酶類標志物。CK和LDH主要作為損傷性標志物反應腦組織損傷的情況。CK在腦組織中主要以腦性同工酶(CK-BB)的形式存在，在血腦屏障未受損的情況下，CK的測定值主要反應CK-BB的活性；LDH在腦中也有表達，但顯著低于外周血中的含量，其與CK類似，也主要反應腦細胞受損的情況。在AD患者腦組織中，神經元細胞損傷、壞死和凋亡的情況較為多見，本研究的結果顯示，DAT患者CSF腦脊液的LDH和CK活性顯著升高，而MCI患者則無此現象，提示CSF LDH和CK活性檢測可作為AD分期的潛在標志物。

谷胱甘肽廣泛存在于動植物體內，是生物體內最重要的非蛋白巰基化合物之一，具有還原型(GSH)和氧化型(GSSG)兩種存在形式，它們與GPx和GR一起構成了重要的氧化還原的控制、調節系統。已有研究表明，氧化應激在AD患者的發病和病程演進中扮演了重要角色，其在細胞自噬、凋亡、基因和蛋白的穩定性等環節均可調節組織細胞的功能狀態，高氧化應激狀態對細胞具有諸多負面影響[19, 20]。本研究納入的患者均為經首都醫科大學宣武醫院神經內科以美國國立老化研究所與阿爾茨海默病協會診斷指南為標準診斷的不同階段AD確診病例，故上述損傷性酶學指標和氧化應激酶學指標的改變具有一定的代表性；結果表明，AD患者CSF中GPx、GR和GSH等代表抗氧化能力的標志物呈下降趨勢，而GSSG等代表氧化應激的標志物呈上升趨勢，反應氧化狀態的GSH/GSSG比值呈下降趨勢，提示通過檢測CSF中的上述氧化應激相關指標可能從一個側面提示腦組織中的氧化應激狀態，以評估患者的疾病進展階段和預后。

綜上所述，本研究結果顯示，AD患者CSF中的LDH和CK等損傷性酶學標志物及GPx和GR等氧化還原酶學標志物在AD的早期診斷和分期中具有一定價值；以CK和GR的截斷值診斷上述疾病具有較好的敏感度和特異性。