白楊素對動脈損傷后新生內膜增生的影響及機制

嚴 玲 關紅菁 朱麗華 唐其柱

血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)的異常過度增殖是經皮冠狀動脈介入治療后再狹窄的主要病理機制之一[1]。在促有絲分裂刺激下，如血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor, PDGF)-BB或血管損傷狀況，多種細胞內信號通路被激活，促進VSMCs異常增殖和再狹窄的發生、發展。這些信號通路包括絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK) 通路、Janus激酶/信號轉導及轉錄激活蛋白(Janus kinase, JAK/ signal transducer and activator of transcription, STAT)通路等[2～4]。針對于抑制VSMCs增殖以及調節信號通路的藥物干預可能成為防治再狹窄的治療策略。

白楊素(chrysin)又被稱為5,7-二羥黃酮(5,7-dihydroxyflavone)，是一種可從蜂膠、蜂蜜及多種植物中提取出的天然化合物，具有抗炎/抗氧化、促凋亡/抗腫瘤、擴張血管、降低血脂、改善內皮功能和胰島素抵抗相關血管并發癥等多種藥理學效應，近年來其心血管保護作用也倍受重視[5～12]。筆者前期的體外實驗顯示白楊素可顯著抑制PDGF-BB引起的VSMCs表型轉換、細胞遷移和異常增殖，然而其對體內小鼠頸動脈損傷后新生內膜增生的作用尚未見報道[13,14]。本研究首次在小鼠動物水平，探討白楊素對頸動脈導絲損傷后新生內膜增生的抑制效應，并且從JNK和STAT信號通路方面，研究白楊素血管保護作用的可能分子機制。

材料與方法

1.材料：SPF級雄性C57BL/6小鼠購自中國醫學科學院醫學實驗動物研究所；金屬導絲(直徑0.38mm, No.C-SF-15-15)購于美國Cook公司；白楊素購于美國Sigma公司；抗增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)抗體購于美國Cell Signaling Technology公司；抗總的及磷酸化的JNK和STAT3抗體購于美國Cell Signaling Technology公司；對二甲氨基偶氮苯(3,3′-diaminobenzidine, DAB)試劑盒購于北京中杉金橋生物技術有限公司；Biotinylated Goat Anti-Mouse IgG (H+L)和Horseradish Peroxidase Streptavidin購于美國Vector公司；檸檬酸鹽抗原修復溶液(pH值為6.0)購于福州邁新生物技術開發有限公司；PDGF-BB購于美國ProSpec公司；DMEM/F12液及胎牛血清購于美國Gibco公司；Immobilon-FL膜購于美國Millipore公司。

2.頸動脈導絲損傷小鼠動物模型的建立、分組與白楊素處理：參照筆者以往建模方法[15～17]，選取10周齡雄性C57BL/6小鼠，腹腔注射戊巴比妥鈉 (3%，90mg/kg)以麻醉小鼠，于頸前部正中切口，分離出頸外動脈后將其結扎，繼而用血管夾夾閉頸內與頸總動脈，阻斷其血流，用顯微剪剪開頸外動脈，將金屬導絲(直徑0.38mm)插入，來回進行5次扭轉進退操作以摩擦動脈管壁，導致頸總動脈的損傷，之后將導絲撤出，結扎頸外動脈切口近心端，縫合皮膚。術后小鼠分成模型對照組(Vehicle組)和白楊素組(Chrysin組)，模型對照組小鼠喂以正常嚙齒類動物飼料，白楊素組小鼠喂以含0.09%白楊素[w/w，如果根據每30g小鼠每天消耗5g飼料計算，相當于150mg/(kg·d)的白楊素給藥劑量]的正常嚙齒類動物飼料，飼養28天。于術后28天將小鼠處死，分離獲取損傷側的頸動脈，用于檢測指標。

3.評價新生內膜形成：4%多聚甲醛固定頸動脈，常規脫水、石蠟包埋、連續切片 (3μm)，蘇木素-伊紅 (HE) 染色評價頸動脈組織形態結構。用Image-Pro Plus 6.0軟件分析計算：內膜面積為內彈力板環繞面積與管腔面積的差值，中膜面積為外彈力板與內彈力板環繞面積的差值，內/中膜比值為內膜與中膜面積的比值。

4.PCNA免疫組化：石蠟切片經脫蠟水化，檸檬酸鹽抗原修復液高壓修復抗原，3%H2O2溶液室溫孵育10min，PBS漂洗后加入10%羊血清37℃封閉1h，滴加抗PCNA抗體4℃孵育過夜，PBS漂洗后加入Biotinylated Goat Anti-Mouse IgG (H+L)室溫孵育2h，PBS漂洗后加入Horseradish Peroxidase Streptavidin 37℃孵育30min，DAB顯色，陽性表達為深褐色，顯色完全后用Mayer蘇木素復染，脫水透明封片。在顯微鏡成像系統(BX51FL/DP72, 日本Olympus公司)下觀察拍照，用Image-Pro Plus 6.0軟件進行圖像分析，數據顯示為新生內膜內PCNA陽性染色的細胞數目。

5.細胞培養：參照參考文獻[13,14]，采用酶消化法分離大鼠主動脈平滑肌細胞，培養在DMEM/F12液(10%胎牛血清)里，待VSMCs生長到近融合狀態時予以傳代。VSMCs的純度利用細胞形態和α-SMA染色鑒定。實驗使用VSMCs為5～12代。

6.細胞周期檢測：參照以往方法，見參考文獻[14]。碘化丙錠 (propidium iodide, PI) 染色法流式細胞儀測定細胞周期分布狀態。VSMCs生長至70%融合時無血清培養24h。12.5μmol/L白楊素預處理1h后，加入PDGF-BB (20ng/ml)刺激24h。胰酶消化VSMCs，70%乙醇固定過夜，800r/min離心10min，收集細胞將其重懸于1ml的PI染色液(含20μg/ml PI和50μg/ml RNaseA)中，避光孵育30min，流式細胞儀檢測各時期的細胞百分比。

7.Western blot法檢測：同以往方法，見參考文獻[13,14]。VSMCs接種至6cm培養皿中，待生長至70%～80%融合時換無血清繼續培養24h。12.5μmol/L白楊素預處理2h后，給予PDGF-BB(20ng/ml)刺激相應的時間。VSMCs用含蛋白酶抑制劑Complete及磷酸酶抑制劑PhosSTOP的細胞裂解溶液裂解，12000r/min離心20min，取上清，BCA法測定蛋白質濃度。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白(上樣量為20μg蛋白/樣本)，隨后轉印至Immobilon-FL膜上。TBST洗膜液封閉1h，加不同的一抗，4℃孵育過夜，之后加IRDye?800CW標記的二抗，室溫孵育1h，Odyssey Imaging System (Li-COR)獲取熒光信號。

結 果

1.白楊素遏制頸動脈損傷后新生內膜增生：本實驗12只小鼠術后均存活，Vehicle組有1只形成血栓未納入分析。頸動脈HE染色顯示，Vehicle組術后28天新生內膜形成非常明顯，而Chrysin組新生內膜增生較模型對照組明顯減輕。形態學數據分析顯示，與Vehicle組比較，Chrysin組的內膜面積和內膜中膜比值均顯著降低，分別為Vehicle組的59.91%和56.04%，差異均有統計學意義 (圖1)。

圖1 白楊素遏制頸動脈損傷后新生內膜增生與模型對照組比較，*P<0.05

2.白楊素遏制新生內膜細胞增殖：頸動脈免疫組化染色顯示術后28天 Chrysin組PCNA陽性細胞表達數較Vehicle組顯著減少, 陽性細胞數僅為Vehicle組的67.93% (圖2)，白楊素可顯著遏制頸動脈損傷后新生內膜內VSMCs增殖，從而減輕新生內膜增生。

圖2 白楊素對新生內膜內PCNA表達的影響與模型對照組比較，*P<0.05

3.白楊素對PDGF-BB處理的VSMCs細胞周期的作用：各組別的細胞周期分布代表圖參見圖3。PDGF-BB刺激VSMCs 24h使G0/G1期細胞占比顯著低于模型對照組，而S期細胞占比明顯高于模型對照組。白楊素預處理顯著抑制PDGF-BB刺激的VSMCs增殖周期變化，使G0/G1期細胞比例顯著升高，而G2/M期細胞比例顯著降低(表1)。

4.白楊素對PDGF-BB引起的VSMCs中JNK磷酸化的作用：Western blot法檢測結果顯示20ng/ml PDGF-BB作用15min后顯著升高VSMCs中JNK的磷酸化表達水平，然而12.5μmol/L白楊素預處理幾乎完全抑制PDGF-BB引起的JNK磷酸化，PDGF-BB和白楊素對JNK總蛋白水平沒有明顯影響(圖4)。

5.白楊素對PDGF-BB引起的VSMCs中STAT3磷酸化的作用：Western blot法檢測結果顯示PDGF-BB作用15min后STAT3即發生顯著磷酸化，并持續到30min，而白楊素預處理顯著降低PDGF-BB對STAT3的磷酸化，PDGF-BB和白楊素對STAT3的總蛋白表達水平沒有顯著影響(圖4)。

圖3 流式細胞術分析各組別的細胞周期分布

表1 白楊素對PDGF-BB處理的VSMCs細胞周期分布的作用

圖4 白楊素對PDGF-BB引起的VSMCs中JNK和STAT3信號通路活化的作用

討 論

VSMCs表型轉換、遷移和異常增殖參與了動脈損傷后新生內膜增生的發生發展。筆者前期研究發現白楊素預處理能阻止PDGF-BB引起的VSMCs收縮表型向合成表型轉換，并顯著抑制PDGF-BB引起的VSMCs遷移[13]。同時，筆者還發現白楊素明顯抑制PDGF-BB引起的VSMCs增殖與DNA合成[14]。這些體外研究結果促使進一步探討白楊素對體內頸動脈損傷后新生內膜增生的作用。本研究利用前期建立的成熟穩定的小鼠頸動脈導絲損傷模型，首次發現口服給予白楊素可顯著抑制新生內膜增生，并明顯降低新生內膜中PCNA陽性細胞表達數[15～17]。該體內實驗結果又進一步驗證了前期體外實驗結果，強有力地支持白楊素對損傷誘導的血管重構的保護效應。

白楊素抑制動脈損傷后新生內膜增生的詳細機制尚未完全闡明。鑒于VSMCs異常增殖加速新生內膜增生，而PDGF-BB能強效刺激VSMCs增殖，本實驗利用體外PDGF-BB誘導VSMCs增殖細胞模型進一步探尋白楊素血管保護作用的可能分子機制。與前期研究一致的是，流式細胞術分析顯示白楊素預處理使PDGF-BB引起的VSMCs增殖停滯在G0/G1期，從而遏制VSMCs增殖[14]。既往研究顯示，JNK通路和STAT3通路的活化與VSMCs異常增殖和新生內膜形成密切相關[2～4]。

本實驗隨后測定了白楊素對上述信號蛋白的影響，結果顯示，在體外培養的VSMCs中，20ng/ml PDGF-BB刺激誘導JNK和STAT3快速磷酸化，而12.5μmol/L白楊素預處理顯著抑制PDGF-BB對JNK和STAT3的磷酸化。該結果提示白楊素抑制PDGF-BB引起的VSMCs增殖的分子機制可能與其減弱JNK和STAT3活化相關。Lee等[18]報道白楊素在人成巨核細胞性白血病MO7e細胞中可抑制干細胞因子誘導的STAT3活化，Lin等[19]報道白楊素還能在人臍靜脈內皮細胞中抑制白介素-6誘導的STAT3活化，這些結果從一定程度上驗證了本研究的可靠性。然而，白楊素究竟通過哪種具體的上游信號分子同時對JNK通路和STAT3通路發揮抑制效應，尚待進一步深入研究。白楊素抑制動脈損傷后新生內膜形成是否與其抑制JNK和STAT3通路活化有直接因果關系還有待進一步動物實驗研究證實。

綜上所述，本研究結果證實白楊素可能經由抑制JNK通路和STAT3通路活化，阻止血管平滑肌細胞異常過度增殖，從而減輕動脈損傷后的新生內膜增生。白楊素有望成為經皮冠狀動脈介入治療后再狹窄的有效防治藥物。