非洲豬瘟的病毒檢測

文│中國動物疫病預防控制中心

由于非洲豬瘟（ASF）缺乏預防用疫苗，為防止疫病的傳播，就需要實施嚴格的衛生和生物安全控制措施，而這就依賴于疫病的快速、可靠的早期診斷。ASF的診斷是指確診動物正在感染或者曾經感染過非洲豬瘟病毒（ASFV）。因此，適用的診斷技術包括檢測和識別ASFV特異性抗原、DNA或抗體的技術，所獲取的檢測信息也是控制和根除計劃的重要保障。在選擇診斷技術時，分析疫病感染期非常重要（圖1）。由于感染動物所處的感染期不同，因此在疫情和控制/根除計劃中，需要同時檢測病毒和抗體以確保準確性。

根據報道，ASF的自然感染潛伏期為4～19天。在臨床癥狀出現的兩天前，ASF感染動物開始散播大量病毒。病毒散播因所感染的ASFV毒株毒力不同而異。感染后約7～9天血清轉陽，抗體陽性可持續終生（見圖1）。

◎圖1 伊比利亞半島及西半球的歐洲家豬中觀察到的血液中病毒和抗體隨著時間的變化及與ASFV感染不同階段的關系（1960—1995年）

病原學檢測為陽性（即抗原）則表明，所檢測的動物在取樣時正在發生感染。而抗體檢測陽性則表明感染正在或者已經發生，包括感染后已經恢復的動物（且可能終身保持血清陽性）。

自2015年底以來，東歐血清學流行病學調查數據顯示血清學陽性動物的檢出率顯著增加，特別是在發生疫情的歐盟國家的野豬群體中尤為明顯。這些結果表明，ASF感染耐過動物可存活超過一個月并可能出現亞臨床感染的病例，就像在伊比利亞半島、美洲和非洲之前所描述的情況。因此，抗體檢測技術對于實施控制和根除計劃所需的完整信息而言是必要的。

一、應用聚合酶鏈式反應（PCR）檢測非洲豬瘟病毒基因組

PCR已成功應用于豬樣品（血液、器官等）和蜱中ASFV基因組的檢測。病毒DNA片段通過PCR擴增獲得足以檢測的量，從而實現檢測。所有經過驗證的PCR技術均可以在臨床癥狀出現前實現檢測。PCR能在樣品到達實驗室數小時內，完成ASF的診斷。PCR是可以代替病毒分離鑒定的一種靈敏、特異、快速的ASFV檢測技術。同時，相比于抗原檢測技術，如酶聯免疫吸附試驗（ELISA）和直接熒光抗體測試（FAT），具有更高的敏感性和特異性。需要注意的是，PCR 的高度敏感性使其容易發生交叉污染，應該采取適當的預防措施來減少和控制污染風險的發生。

OIE在《陸生動物診斷試驗和疫苗手冊》（2016年）中推薦使用的常規和實時熒光PCR得到了長期的充分驗證，是常規診斷的重要工具。此外，除了OIE推薦的適用于康復動物ASF基因組檢測的實時熒光PCR技術外，其他研究者建立的實時熒光PCR已經證實更為敏感。在這些分子技術中使用的引物和探針多以VP72編碼區域作為靶基因設計，該基因片段是ASFV基因組中研究清楚，且高度保守的區域。應用這些PCR技術，即使在滅活或降解的樣品中也可檢測到已知所有22種p72病毒基因型的多個毒株。

對于特急性、急性或亞急性ASF感染病例，PCR是首選的檢測技術。此外，由于PCR檢測病毒基因組，即使病毒分離鑒定為陰性的，含有無感染性病毒粒子的樣品，也可完成檢測，這也使其成為用于檢測感染低或中等毒力毒株的重要工具。雖然PCR不能提供病毒感染性的信息，但可以提供定量的信息。

二、非洲豬瘟病毒分離

病毒分離是將樣品接種易感的豬源原代細胞、單核細胞和巨噬細胞而進行的檢測。如果在樣品中存在ASFV，則會在易感細胞中復制，在感染細胞中產生細胞病變（CPE）。細胞裂解和CPE通常在出現紅細胞吸附現象的48～72小時后發生。ASFV的紅細胞吸附試驗是該病毒特有的檢測技術，其他豬源病毒在白細胞培養物中不存在紅細胞吸附特性。當病毒在這些培養物中復制時，多數ASFV毒株會產生紅細胞吸附反應（HAD），在感染的白細胞周圍吸附豬紅細胞形成“玫瑰花環”（見圖2）。

◎圖2 紅細胞吸附反應（HAD）

此外，需要說明的是，在沒有發生紅細胞吸附反應的時候出現CPE，可能是由于接種物的細胞毒性所致或者由于其他病毒（如偽狂犬病毒）感染或者由于不產生紅細胞吸附反應的ASFV毒株導致。一旦發生這類情況，必須采用其他的病毒學檢測技術（如FAT或PCR），檢測細胞沉淀物是否存在ASFV。而如果細胞分離沒有觀察到任何變化，或者FAT和PCR檢測為陰性，則需要將細胞培養上清-再次接種新的培養物種，連續傳代3～5代，之后方可確認為ASFV陰性。

對于抗原檢測（ELISA、PCR或FAT）為陽性的樣品，推薦HAD為完成病毒分離和鑒定的參考試驗。而如果通過其他方法已經證實ASF感染，特別是在首次暴發ASF的地區，也建議使用紅細胞吸附試驗鑒定病毒。此外，病毒分離對于進一步的分子生物學研究也是必要的基礎。

三、直接熒光抗體法對非洲豬瘟抗原的檢測

FAT可用于檢測豬組織中的ASFV抗原。檢測原理是通過顯微觀察感染臟器涂片或薄層冷凍切片上的病毒抗原實現的。使用異硫氰酸熒光素（FITC）結合的特異性抗體檢測細胞內抗原。FAT也可用于檢測未觀察到HAD的白細胞培養物中的ASFV抗原，因此可以鑒定不產生HAD反應的ASFV毒株。FAT還可用于鑒別CPE是由ASFV感染導致的，還是由其他病毒感染或者導致的接種的細胞毒性導致的。

陰陽性對照是保證切片被正確判定的重要保障。該方法也是對特急性和急性ASF病例的高度敏感的檢測技術，且可以非?？焖俚赝瓿蓹z測。雖然FAT是高效的檢測技術，但目前已被PCR逐步取代，所需試劑也不再廣泛使用。然而值得一提的是，在亞急性和慢性型感染中，FAT的敏感性明顯降低（40%）。

四、ELISA對非洲豬瘟抗原的檢測

使用ELISA檢測病毒抗原，其成本比PCR更為低廉，并且可在沒有特殊的實驗室儀器設備的條件下，短時間內對樣品的大規模篩查。然而，與FAT相似，對于亞急性和慢性病例，抗原ELISA的敏感性明顯較低。同時，現地樣品通常狀態不佳，因此也降低了檢測的敏感性。因此建議抗原ELISA（或其他ELISA）主要用于“群體”檢測，并輔助以其他病毒學和血清學檢測（見圖3）。（注：本文節選自《聯合國糧食及農業組織（FAO）動物生產及衛生手冊》）

◎圖3 FAT在ASFV感染的扁桃體中的定位檢測