美國國家家禽改良計劃標準程序（2014版）—細菌學檢查程序（1）

譯校│顧小雪 張倩 張淼潔（中國動物疫病預防控制中心）

1 對環境中腸炎沙門氏菌呈陽性的蛋雞和肉雞種群進行細菌學檢查的實驗室推薦程序

環境監測后，從腸炎沙門氏菌陽性的蛋雞和肉雞種群中抽樣進行細菌學檢查，應按照本“方案標準”第2（a）節所述方法進行。

2 對家禽進行沙門氏菌細菌學檢查的實驗室推薦程序

（a）蛋雞、肉雞、火雞、水禽、觀賞用家禽和野禽。所有對雞白痢－雞傷寒試驗有反應的禽類（至多25只）和來自于腸炎沙門氏菌陽性環境的禽類應根據本節第（a）（1）段的方法進行直接增菌培養和第（a）（2）段的方法進行選擇性增菌培養，如果該雞群中對雞白痢－雞傷寒試驗有反應的雞的數量超過四只，如《聯邦法規匯編》所規定的，至少要將四只雞提交給授權實驗室做細菌學檢查。采集所有組織樣本時應采用嚴格的無菌操作技術。

（1）直接培養（參見圖1）。對于大體正常或患病的肝臟、心臟、心包囊、脾臟、肺、腎、腹膜、膽囊、輸卵管，畸形卵細胞或睪丸，發炎或未吸收的卵黃囊和其他肉眼可見的膿性、壞死性或增殖性病變的病理組織（包括囊腫、膿腫、眼前房積膿和發炎的漿膜表層），可用加熱后的金屬接種環或滅菌拭子取樣做直接培養。由于某些菌株在某些選擇性培養基中不一定能存活或生長，因此接種非選擇性培養皿（如血液或營養瓊脂）和選擇性培養皿【如用于檢測可疑雞白痢沙門氏菌或雞沙門氏菌的麥康凱瓊脂平皿（MAC）和煌綠新生霉素平皿（BGN）以及用于檢測腸炎沙門氏菌的MAC平皿、BGN平皿和木糖賴氨酸Tergitol 4平皿】。推薦的細菌學復蘇和鑒定程序請參考圖1。采集器官和組織后應立即進行選擇性增菌培養。

◎圖1 對腸炎沙門氏菌陽性環境的禽類和雞白痢－雞傷寒有反應的禽類的分離培養程序

（2）選擇性增菌培養（參考圖1）。器官樣本的采集與培養應與腸道樣本分別進行，最后采集腸組織防止交叉感染。應從如下器官或位置采集樣本用于選擇性增菌液培養： （i）心臟（如果存在的話，心尖、心包囊及內含物）；（ii）肝臟（病變部位，或在大致正常的器官中，排空的膽囊和相鄰肝臟組織）；（iii）卵巢－睪丸（整個無活性的卵巢或睪丸，但如果卵巢有活性，則包括任何非典型卵細胞）；（iv）輸卵管（如果有活性，則包括任何碎屑和脫水的卵細胞）；（v）腎臟和脾臟；（vi）其他肉眼可見的膿性、壞死性或增生性病變的病理部位。

（3）在無菌的環境下，從每一只家禽身上，采集10至15克本節第（a）（2）段中列出的任何器官或部位。絞碎、磨碎或混合并置于無菌自封袋中。從同一只家禽身上采集的本節第（a）（2）中列出的任何器官或部位樣本可放在一個自封袋中。不要將不同家禽的樣本混在一起。加入足量的四硫酸鹽增菌液進行增菌，稀釋比例為1∶10。在37℃～42℃下，將樣本孵育20至24小時。按照圖1中敘述的步驟分離和鑒定沙門氏菌。

（4）在無菌的環境下，從每一只家禽身上，采集10至15克消化道的不同部位，具體如下：嗉囊壁、十二指腸空腸（包括卵黃囊殘余部分）、盲腸、盲腸扁桃體、直腸泄殖腔。絞碎、磨碎或混合各種組織，并將它們放在一個無菌自封袋中。不要將不同家禽的組織樣本混在一起。加入足量的四硫酸鹽增菌液進行增菌，稀釋比例為1∶10。按照圖1中敘述的步驟分離和鑒定沙門氏菌。

（5）選擇性增菌后，接種選擇性平皿（如用于檢測雞白痢沙門氏菌或雞傷寒沙門氏菌的麥康凱瓊脂平皿和煌綠新生霉素平皿，以及用于檢測腸炎沙門氏菌的麥康凱瓊脂平皿、煌綠新生霉素平皿和木糖賴氨酸Tergitol 4平皿）。將平皿置于37℃下孵育20至24小時。從該平皿中選擇3至5個可疑沙門氏菌菌落接種三糖鐵（TSI）和賴氨酸鐵瓊脂（LIA）斜面。如果經過24小時培養沒有發現可疑菌落，則繼續孵育平皿24小時，再判斷其是否為陰性。按照圖1中的流程，對菌落進行血清學（即血清群）和生物化學（例如，腸桿菌科鑒別系統[API]）鑒定。

（6）如果初始的選擇性增菌后，沙門氏菌呈陰性，則需采用延遲第二次增菌（DSE）程序。將富含四硫酸鹽的樣本在室溫下放置5至7天。將1毫升培養液轉移到含有10毫升新鮮四硫酸鹽增菌液的試管中，并在37℃下孵育20～24小時。

（7）對所有分離菌株進行沙門氏菌血清群鑒定，并對所有D1群沙門氏菌進行血清型鑒定。對所有腸炎沙門氏菌分離菌進行噬菌體型鑒定。

3 從雞舍環境樣本、泄殖腔拭子和孵化室樣本中采集、分離和鑒定沙門氏菌的程序

從養殖者那里獲得與雞舍布局和每個雞舍中雞只數量相關的信息，以確定應從每個雞舍和每個雞群采集的樣本數量。應根據雞舍來源提供每個樣本的鑒定方法。運送采樣人員的車輛應盡可能地遠離禽舍。應遵循生物安全措施，包括使用已消毒的采樣設備、無菌采樣用品和做好個人清潔。采樣前，工作人員應小心地用消毒皂清洗雙手。前往不同的養殖場時，應更換包括手套在內的外衣，確保每次都穿著干凈的衣物進入每個養殖場。無菌紗布的最小尺寸應為3×3英寸。

使用過的干凈衣服和采樣材料應分開放置。在進入不同養殖場前，應對靴子或鞋子進行清潔和消毒。每個養殖場都應提供一次性帽子或發網，且在使用后當場丟棄。采集好樣本后，應避免干燥、光照和溫度過高，并在一天內送往實驗室。若遞送延遲，應將樣本放在冷藏環境中。

（a）蛋雞和肉雞、火雞、水禽、觀賞用禽和野禽。 本段所描述的所有樣本和拭子均應按照圖2進行培養。所有采集到的沙門氏菌均應按血清群或血清型進行分類。

（1）雞舍環境樣本。（i）糞便、垃圾或灰塵。用佩戴干凈手套的手或無菌收集裝置從代表雞舍所有區域的幾個位置收集糞便、垃圾或灰塵到無菌袋或容器中。在不超過500只雞的雞舍中，建議采集5個樣本；在500至2500只雞的雞舍中，建議采集10個樣本；在超過2500只雞的雞舍中，建議采集15個樣本。

（ii）拖曳拭子（DS）。拖曳拭子由紗布墊或市售海綿組成，能夠保證對雞舍進行大面積的取樣。

制備。用戶既可以通過商業途徑購買拖曳拭子，也可以自己制備。推薦一個制備拖曳拭子的方法：將無菌紗布片對折，用回形針、訂書釘或類似的裝置將一根2英尺（60厘米）長的麻繩牢牢地系在對折的紗布片上。用類似的方法將第二個無菌紗布片固定到一根5英尺（150厘米）長的麻繩上。然后將較短的麻繩和較長的麻繩系在一起，制成一個由兩個拭子呈Y字形布置的拖曳拭子。或者，用戶也可以制備兩個獨立的拖曳拭子取樣器。將麻繩纏繞在拭子周圍，拭子用雙倍脫脂牛奶（DSSM）沾濕。將沾濕的拭子放在儀器箱中。裝在該儀器箱中的無菌拭子在使用前都可進行冷凍保存，以防變干。

步驟。在養殖場解開解凍后的拖曳拭子，佩戴手套握緊麻繩末端。在雞舍環境表面拖曳拭子15分鐘或在整個雞舍內（來回）拖曳。一組拭子（兩片獨立的紗布）從雞舍內部的地板中央拖過，另一組拭子（兩片獨立的紗布）從雞舍內部的地板周邊拖過。四片紗布分別放在貼有標簽的無菌袋中。如果需要防止干燥的話，可向袋內加入額外的雙倍脫脂牛奶（濃縮的脫脂乳）。袋子應避免高溫，盡快提交至授權實驗室進行檢測。如果樣本不能在當天送至實驗室，則在培養前，應將其保存在2至4℃，或放入裝有冰塊或冰袋的冷藏箱中，保存時間不得超過5天。

（iii）鞋套拭子。采用可吸收的布鞋套的原理，使鞋套的底部與地板垃圾和板條區域接觸。戴上干凈的手套，將鞋套套在僅在雞舍內穿著的鞋子上。鞋子可以是雞場專用鞋，也可以是一次性套鞋。工作人員穿著鞋套應以正常速度步行超過1000英尺（305米）。當雞群中少于500只雞時，在養雞區域地板上取樣時應至少準備1雙鞋套。當雞群中有500或更多只雞時，在養雞區域的地板上取樣時應至少準備2雙鞋套。采樣后，將鞋套分別放進裝有30毫升雙倍脫脂牛奶的無菌容器中，若使用的是提前浸潤的拭子則不用額外添加。封閉無菌容器，立即將它們放在2～4℃下冷藏，或放入裝有冰塊或冰袋的冷藏箱中。不要冷凍。培養前，樣本在2～4℃冷藏不得超過5天。

（iv）產蛋箱或集蛋帶拭子可作為替代樣本。用兩個無菌且提前浸濕（例如，用雙倍脫脂牛奶）的紗布或海綿在產蛋箱內大約10%的區域進行擦拭。將每一個拭子或海綿放入單獨的無菌袋中，并提交至授權實驗室。

用兩個無菌且提前浸濕（例如，用雙倍脫脂牛奶）的紗布或海綿擦拭集蛋帶。每一個拭子至少擦拭30英尺的集蛋帶材料。將拭子分別放入單獨的無菌袋中，并提交至授權實驗室。

（2）泄殖腔拭子。應按照本節中描述的步驟，從雞群或至少500只雞中采集用于細菌學檢驗的泄殖腔拭子。采用正確的方法，將無菌棉簽或拭子插入禽類泄殖腔和直腸中，采集糞便物質。可將棉簽折斷放入到無菌試管中。泄殖腔拭子可以按照5的倍數或授權實驗室指定的規格進行組合。

（3）孵化室樣本。可通過檢查孵化室相關的樣本，如小雞箱紙、胎糞和絨毛，來確定是否存在沙門氏菌，從而判斷沙門氏菌由母體傳給后代的可能性。

（i）小雞箱紙。授權代理人可根據本節第（a）（3）（i）段介紹的方法采集小雞箱紙樣本或 按照本節第（a）（3）（ii）段中的方法，直接交給授權實驗室進行檢測。在將小雞箱放入孵化室前，將紙從小雞箱中取出這一步非常重要。

小雞箱紙采樣說明。一棟雞舍中，每10箱小雞需采集一個小雞箱紙樣本。用消毒后和佩戴手套的雙手將紙放在干凈、無菌的表面上。用雙倍脫脂牛奶將無菌紗布或海綿浸透，然后擦拭5個小雞箱紙的表面。用紗布擦拭每一個箱紙樣本75%以上的面積，并使勁擦掉所有干燥的胎糞。加入更多的雙倍脫脂牛奶更有助于采樣。用第2個拭子在另外5個小雞箱紙上重復這一步驟。將這兩個拭子放入同一個無菌且貼有標簽的塑料袋中，并提交至授權實驗室。立即將含有樣本的Whirl－Pak采樣袋用冰袋或其他制冷設備進行冷藏并在采樣后5天內送往實驗室培養。

（ii）本計劃參與者可將小雞箱紙直接提交到實驗室，實驗室將按照本節第（a）（3）（i）段描述的方法收集樣本。將小雞箱紙直接提交到實驗室需要：

從放置在一棟雞舍的每10個小雞箱中采集1個小雞箱紙，立即將小雞箱紙放入大的塑料袋中，貼上標簽并密封包裝。

將含有小雞箱紙的塑料采樣袋放入一個干凈的盒子中，并在48小時內將其運往實驗室。塑料采樣袋無需冷藏保存。

（iii）小雞胎糞。采樣后，將容器中的胎糞進行混合，以獲得均勻的稠度。實驗室將取出25克樣本用于細菌學檢驗。

（ⅳ）絨毛。可以從孵化室地板上或孵化后的托盤中收集絨毛樣本。可以用提前浸透的紗布或海綿擦拭地板或托盤來收集絨毛樣本，或將絨毛材料直接放入無菌采樣袋中。

（b）沙門氏菌的分離鑒定 。如本節所述（見圖2），可通過兩種增菌程序進行沙門氏菌的分離。或者可以采用快速方法來檢測沙門氏菌，并對陽性樣本進行細菌分離。

（1）直接用四硫酸鹽增菌液増菌后用微量半固體氯化鎂孔雀綠（MSRV）增菌。

（i）按照1∶10的比例（樣品∶增菌液），將新鮮的四硫酸鹽增菌液加入到樣本中。37或42℃孵育20至24小時。

（ii）孵育后，將大約100微升（3滴）的增菌液（表面以下的）加入到微量半固體氯化鎂孔雀綠平皿中。正面朝上， 42℃孵育24小時。

（iii）觀察微量半固體氯化鎂孔雀綠平皿，看是否存在從接種端轉移過來的生長帶。如果存在的話，將無菌接種環插入生長帶的外緣，接種選擇性瓊脂平皿，如煌綠新生霉素平皿和XLT4平皿。

（iv）如果沒有出現生長帶，則將微量半固體氯化鎂孔雀綠平皿放置在42℃環境下再孵育24小時。觀察微量半固體氯化鎂孔雀綠平皿，看是否存在從接種端轉移過來的生長帶。如果存在的話，將無菌接種環插入生長帶的外緣，接種選擇性瓊脂平皿，如煌綠新生霉素平皿和XLT4平皿。如果還是沒有出現生長帶，將該接種環插入到接種端，并接種選擇性瓊脂平皿。這樣以確保不漏檢虛弱或無運動性的沙門氏菌菌株。

（v）將選擇性瓊脂平皿在37℃孵育20至24小時。觀察平皿是否出現沙門氏菌疑似菌落。挑取3至5個菌落，分別接種三糖鐵（TSI）和賴氨酸鐵（LIA）瓊脂斜面或其他類似的方法。37℃孵育20至24小時。按照圖2中的血清學（即血清群）或生化（如API）程序篩選菌落。

◎圖2 雞舍環境樣本、泄殖腔拭子和孵化室樣本培養流程

（vi）將所有鑒定為沙門氏菌的分離株按血清群進行分群，并將所有D群分離株進行血清型鑒定。對每個雞群每次鑒定出的腸炎沙門氏菌進行噬菌體分型。

（2）預增菌后進行選擇性增菌。（i）將預增菌液（如緩沖蛋白胨水，BPW）按1∶10的比例（樣本∶增菌液）加入到樣本中。37℃孵育20至24小時。（ii）將1毫升預增菌樣本轉移到含有10毫升四硫酸鹽增菌液的培養管中，然后將0.1毫升轉移到含有10毫升氯化鎂孔雀綠增菌液的培養管或微量半固體氯化鎂孔雀綠平皿中。42℃孵育20至24小時。（iii）孵育后，將四硫酸鹽和氯化鎂孔雀綠增菌液接種到不同的選擇性瓊脂平皿上，如煌綠新生霉素平皿和XLT4平皿。微量半固體氯化鎂孔雀綠培養基接種后，按照（I）（iii）和（1）（iv）中的步驟進行。（iv）按照（I）（v）和（I）（vi）所述的方法，用選擇性瓊脂培養基篩選沙門氏菌。

（3）經認可的沙門氏菌快速檢測方法。（i）根據《聯邦法規匯編》規定，《美國國家家禽改良計劃》可批準用沙門氏菌的快速檢測方法。（ii）各種快速檢測方法所用到的增菌和檢測程序是經制造商推薦并由《國家家禽改良計劃》批準。（iii）“分子檢查程序”部分列出了批準的分子檢查程序。（iv）經快速檢測方法確定為陽性的樣品，必須通過接種選擇性培養基，如煌綠新生霉素平皿和XLT4平皿確證是否為沙門氏菌，接種液為鑒定過程中的增菌液。（v）遵循本節第（b）（1）（v）中的分離程序。