高效捕獲阪崎腸桿菌免疫磁珠的制備研究

姚驊珊，朱志強

（蘇州健雄職業技術學院醫藥科技學院，江蘇太倉215411）

阪崎腸桿菌（Enterobactor sakazakii E.sakazakii）屬腸桿菌科，是一種棒狀革蘭氏陰性食源性致病菌[1]，被FAO/WHO認定為A類危害微生物，可引起嬰幼兒腦膜炎、敗血癥和致死性小腸結腸炎等疾病，特別是早產兒及免疫力低下人群[2]，死亡率高達20%～50%，即使使用抗生素治療康復，也會伴隨著嚴重的神經系統后遺癥和發育障礙等癥狀[3]。研究發現，阪崎腸桿菌具有較高的耐熱性和極強的耐干燥特性[4]，奶粉是該菌的主要感染渠道[5]。嬰兒配方粉質食品中微量的阪崎腸桿菌污染（＜3 CFU/100 g）也能導致感染發生[6]。為防止和控制奶粉制品中阪崎腸桿菌的污染和傳播，建立一種高效且靈敏的檢測阪崎腸桿菌的方法十分必要。目前較為常用的阪崎腸桿菌檢測方法是FDA認可的經典檢測程序——嬰兒配方奶粉中阪崎腸桿菌的分離與計數[7]，該法包括增菌、顯色培養、生理生化鑒定三步，檢測對樣品需求量大，步驟繁瑣，耗時長，大約需要5～7天才能獲得檢測結果，且準確度和特異性不高。近年來，利用免疫磁珠和定量PCR相結合檢測食品中致病菌的方法相繼被報道[8-10]，本研究在傳統免疫磁珠制備的基礎上，引入親和力更高的鏈霉親和素——生物素系統，提升磁珠與抗體偶聯量，并優化捕獲體系，建立起一種高效、靈敏、特異性強的阪崎腸桿菌分離方法，為該菌的精確檢測奠定基礎。

1 實驗部分

1.1 菌株

阪崎腸桿菌（ATCC 29544）、阪崎腸桿菌（ATCC51329）、大腸桿菌（ATCC 25922）、腸炎沙門氏菌（CMCC（B）50041）、金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）、單增李斯特菌（ATCC19115）均購自上海桑戈生物科技有限公司。

1.2 試劑與儀器

嗎啉乙磺酸 （MES，SIGMA）；碳二亞胺（EDC，SIGMA）；N- 羥基琥珀酰亞胺（NHS，SIGMA）；鏈霉親和素（SA，SIGMA）；活潑酯化的長鏈生物素（Biotin，Pierce）；兔抗阪崎腸桿菌多克隆抗體（北京solarbio訂制）；其他分析純試劑（上海國藥集團化學試劑有限公司）；C503021BCA蛋白質定量檢測試劑盒（上海生工生物工程有限公司）。

EVM-80垂直旋轉混勻儀（美國 Essenscien）；Multiskan MK3酶標儀（美國Thermo）；MS-12奧磁多功能磁分離器（上海奧潤納新材料有限公司）；PM3-008羧基磁珠（平均粒徑80 nm）；PM3-035羧基磁珠（平均粒徑 350 nm）；PM3-100羧基磁珠（平均粒徑 1 μm）（上海奧潤微納新材料科技有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 抗體的生物素標記

按照Pierce公司說明書，將溶解于磷酸鹽緩沖液（PBS,pH 7.0）的生物素與抗體按照物質的量比3∶1混合，標記后產物于4℃透析72 h，以體積比1∶1加入甘油，保存于-20℃備用。

1.3.2 磁珠與鏈霉親和素（SA）的偶聯

活化：取10 mg羧基修飾磁珠，依次用無水乙醇、1 mol/L NaOH、1 mol/L HCl及0.01 mol/L嗎啉乙磺酸溶液（MES,pH 6.0）洗滌。用4℃的MES溶液（0.01 mol/L,pH 6.0）分別配制5 mg/mL的EDC和NHS溶液，向磁珠中分別加入等體積上述EDC和NHS溶液，置于垂直旋轉混勻儀上保持磁珠懸浮，37℃活化45 min，磁分離器回收磁珠，PB溶液（0.02 mol/L,pH 8.0）洗滌3次后重懸。偶聯：取活化后的磁珠與適量鏈霉親和素進行偶聯，37℃反應1 h。磁分離器回收磁珠。封閉：加入含1%牛血清白蛋白（BSA）的 PBS溶液（pH 8.0）重懸磁珠，37℃封閉45 min。保存：PBS溶液（pH 8.0）洗滌磁珠3次，用含0.05%Na3N的PBS（0.02 mol/L,pH 8.0）保存緩沖液重懸，4℃備用。偶聯后用BCA法檢測上清剩余鏈霉親和素濃度，根據標準曲線計算單位質量磁珠和鏈霉親和素偶聯量及偶聯效率。BCA試劑盒使用按照說明書進行。公式如下：

1.3.3 鏈霉親和素免疫磁珠的合成

將1.3.2中獲得的鏈霉親和素磁珠和生物素化阪崎腸桿菌兔抗進行偶聯，37℃反應30 min。磁分離器回收磁珠，PB溶液洗滌3次，用含0.05%Na3N的PBS（0.02 mol/L,pH 8.0）緩沖液重懸，4℃備用。抗體偶聯率測定方法：采用BCA試劑盒測定磁珠偶聯反應后上清液蛋白含量。

1.3.4 鏈霉親和素免疫磁珠捕獲效率

將阪崎腸桿菌（ATCC 29544）接種到LB培養基中，37℃振蕩培養24 h，經平板涂布計數法計數后，用滅菌PBS溶液（0.01 mol/L,pH 7.0）將菌液濃度調整到105 CFU/mL，向1 mL菌液中加入適量鏈霉親和素免疫磁珠，置于混勻儀上室溫孵育。磁分離器分離3 min，棄上清，回收的磁珠用PBS清洗兩次后重懸，將重懸液梯度稀釋后進行菌落計數，每個梯度3個平行，培養溫度為（37±1）℃，時間18～24 h，計算公式如下：

1.3.5 鏈霉親和素免疫磁珠特異性評價

將實驗室保存的阪崎腸桿菌（ATCC29544）、阪崎腸桿菌（ATCC51329）、大腸桿菌（ATCC 25922）、腸炎沙門氏菌 （CMCC（B）50041）、金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）、單增李斯特菌（ATCC19115）過夜培養后稀釋到105～106 CFU/mL，然后分別向1 mL菌液中添加0.3 mg鏈霉親和素免疫磁珠，置于混勻儀上室溫孵育30 min。磁力架分離磁珠并用PBS重懸，將磁珠重懸液梯度稀釋后進行平板菌落計數，之后步驟同1.3.4，用以評價免疫磁珠特異性。

1.3.6 免疫磁珠對人工污染樣品中阪崎腸桿菌的捕獲實驗

稱取奶粉、米粉各25 g，牛奶和蛋液（打勻）各25 mL，分別加入到225 mL PBS緩沖液中，按照105 CFU/mL接種阪崎腸桿菌，制備人工污染樣品。取上述樣品各1 mL，加入0.3 mg免疫磁珠，置于混勻儀上室溫孵育30 min。磁力架分離磁珠并用PBS重懸，將磁珠重懸液梯度稀釋后進行平板菌落計數，之后步驟同1.3.4，用以計算免疫磁珠在模擬樣品中的捕獲效率。

2 結果與分析

2.1 鏈霉親和素免疫磁珠的制備

2.1.1 鏈霉親和素和磁珠的偶聯量及偶聯效率

取同量經EDC、NHS活化的磁珠1 mg，分別加入10 μg、30 μg、50 μg、70 μg、100 μg、120 μg 的 SA 進行偶聯反應，37℃反應1 h。結果如圖1所示，隨反應體系中SA添加量的提高，鏈霉親和素的偶聯量分別為6.5 μg/mg、19.1 μg/mg、28.9 μg/mg、38.4 μg/mg、51.2 μg/mg和52.8 μg/mg磁珠，偶聯率為64.8%、63.8%、58.0%、54.8%、51.2%和44.0%，表明SA與磁珠的結合量隨SA添加量的增大而增加，但偶聯效率有所下降。考慮到制作成本，選取偶聯量和偶聯效率均較高的51.2 μg/mg磁珠組，即每mg磁珠中SA的添加量為100 μg進行后續實驗。

圖1 鏈霉親和素加入量對偶聯量和偶聯效率的影響Fig.1 Effect of streptavidin amount on coupling and efficiency of magnatic beads

2.1.2 生物素化抗體與磁珠偶聯量

取SA偶聯量和偶聯效率均較高的鏈霉親和素磁珠（51.2 μg/mg磁珠，1 mg/份），加入生物素化免抗阪崎腸桿菌多克隆抗體。由于每個鏈霉親和素分子有4個生物素結合位點，理論上生物素化抗體與鏈霉親和素磁珠反應比值為4∶1，但考慮到空間位阻，按照抗體添加量與磁珠上鏈霉親和素物質的量之比為1∶1，2∶1，3∶1，4∶1進行。結果如圖2所示，生物素化抗體結合量隨抗體添加比例的增大而增加。當抗體添加比例為3∶1時，抗體結合量分別為386.6 μg/mg磁珠，結合量趨向飽和。在保證吸附能力的同時，兼顧制備成本，免疫磁珠制備工藝確定為：按照100 μgSA/mg磁珠制備鏈霉親和素磁珠，以抗體與磁珠表面鏈霉親和素物質的量比為3∶1進行免疫磁珠的制備。

圖2 抗體加入量對偶聯量的影響Fig.2 Effect of antibody amount on coupling

2.2 菌體捕獲條件的優化

2.2.1 免疫磁珠用量對捕獲效率的影響

取4份濃度為105 CFU/mL的菌液各1 mL，分別加入 0.1 mg、0.2 mg、0.3 mg、0.5 mg磁珠，置于混勻儀上室溫孵育30 min。磁力架分離磁珠后，PBS重懸磁珠進行菌落計數，計算免疫磁珠的用量對捕獲效率的影響。結果如圖3所示，隨著免疫磁珠用量的加大，捕獲效率不斷提高。當磁珠用量為0.3 mg時，阪崎腸桿菌的捕獲率為82.5%；磁珠用量為0.5 mg時，捕獲效率為83.5%。表明當磁珠用量達到0.3 mg時，捕獲效率趨于穩定，即使增加磁珠用量，捕獲效率也沒有明顯提高，所以選擇0.3 mg為最佳磁珠添加量。

圖3 免疫磁珠添加量對捕獲效率的影響Fig.3 Effect of immunomagnetic beads amount on adsorptio n efficiency

2.2.2 時間對捕獲效率的影響

取4份濃度為105 CFU/mL的菌液各1 mL，分別加入0.3 mg免疫磁珠，置于混勻儀上室溫孵育15 min、30 min、45 min、60 min。磁力架分離磁珠，PBS重懸，梯度稀釋后進行菌落計數，計算不同捕獲時間的捕獲效率。結果如圖4所示，不同孵育時間的捕獲效率分別為70.5%、82.9%、84.3%和84.0%，說明孵育時間為30 min時達到平衡，即使延長孵育時間，捕獲率也沒有明顯提升，因此選擇30 min為最優捕獲時間。

圖4 孵育時間對捕獲效率的影響Fig.4 Effect of incubation time on adsorption efficiency

2.2.3 免疫磁珠粒徑對捕獲效率的影響

分別選用磁珠 PM3-008（平均粒徑 80 nm）、PM3-035（平均粒徑350 nm）、PM3-100（平均粒徑1 μm）按照最優方案制備鏈霉親和素免疫磁珠，在磁珠添加量為0.3 mg、孵育時間30 min條件下計算捕獲效率。圖5結果說明，在純培養體系中捕獲效率和磁珠粒徑成反比，粒徑為80 nm、350 nm和1 000 nm的免疫磁珠捕獲效率分別為83.5%、66.5%和23.0%，納米磁珠表現優于微米磁珠。

圖5 磁珠粒徑對捕獲效率的影響Fig.5 Effect of particle size of immunomagnetic beads on adsorption efficiency

2.3 鏈霉親和素免疫磁珠特異性評價

利用粒徑為80 nm的免疫磁珠對2株阪崎腸桿菌和4株非阪崎腸桿菌菌株分別進行捕獲實驗，圖6結果顯示對2株阪崎腸桿菌的捕獲效率達到80%以上，而對4株非阪崎腸桿菌的捕獲效率均不超過5.0%，推測是由于非特異性吸附造成的。在4株非阪崎腸桿菌和1株阪崎腸桿菌混合菌液中進行捕獲，對阪崎腸桿菌的捕獲效率為80.5%，幾乎不受其他雜菌的影響，說明本實驗制備的免疫磁珠特異性高，抗干擾能力較強。

圖6 免疫磁珠特異性實驗Fig.6 Test of specificity of immunomagnetic beads

2.4 免疫磁珠對人工污染樣品中阪崎腸桿菌的捕獲效率

免疫磁珠在模擬樣品中的捕獲效率均低于純培養中的捕獲效率，在米粉、奶粉、牛奶、蛋液中的捕獲效率分別為70.8%、79.5%、78.0%和61.1%。其中在牛奶和奶粉中的捕獲效率接近純培養捕獲效率，在蛋液中的捕獲效率最低，推測由于牛奶、奶粉模擬樣品的粘度較小，而蛋液粘稠度過高，影響免疫磁珠的流動性，阻礙磁珠與菌體的接觸，干擾捕獲，見圖7。

圖7 不同人工污染樣品對捕獲效率的影響Fig.7 Effect of different artificial pollution samples on adsorption efficiency

3 討論與展望

在磁珠粒徑對捕獲效率影響實驗中，結果顯示納米級磁珠優于微米磁珠，同樣的結果在之前的研究中也多次被證明。鐘子清等[9]比較了180 nm和1 150 nm粒徑免疫磁珠對單增李斯特菌的捕獲效果，結果顯示，當磁珠用量為0.1 mg時，180 nm鏈霉親和素免疫磁珠捕獲效率高達95%，而1 150 nm磁珠僅為9%，并通過電鏡觀察結果證實。山珊等[10]研究發現在相同條件下，1 150 nm免疫磁珠對沙門氏菌的捕獲效率不足180 nm免疫磁珠的一半。本次實驗的結果也很好地印證了這一觀點，粒徑80 nm的免疫磁珠捕獲效率最高。分析原因有三點：第一，納米磁珠比表面積大，受到的空間位阻效應小，和菌體表面抗原表位的結合量提高；第二，菌體表面結合的免疫磁珠數量增加后，在磁分離過程中菌體脫離免疫磁珠的可能性降低；第三，納米磁珠由于粒徑小，在溶液中分散性更好，熱運動作用比微米磁珠強，和菌體抗原表位接觸的概率增加。而微米級免疫磁珠存在較大的空間位阻效應，導致磁珠與菌體結合位點減少，不但不易捕獲到菌體，及時捕獲后也容易在磁分離時脫離。

本實驗制備了鏈霉親和素——生物素介導偶聯的免疫磁珠，用于捕獲阪崎腸桿菌。由于鏈霉親和素與生物素間極高的親和力，此種方法比抗體直接和磁珠偶聯的方法能夠在單位質量磁珠表面結合更多抗體，從而提高捕獲效率。在1 mL體系中添加粒徑為80 nm的鏈霉親和素免疫磁珠0.3 mg孵育30 min，純培養條件下對阪崎腸桿菌捕獲效率在80.5%以上，人工污染樣品條件下捕獲效率可達61.1%以上，非特異性低于5.0%，為進一步優化富集體系提供了研究方向。如果結合核酸提取、熒光定量PCR技術等，不但大大縮短致病菌的檢測時間，而且將大幅提高檢測的靈敏度和特異性。

在實驗中發現捕獲菌體過程中，免疫磁珠的利用度不高，體系中添加的免疫磁珠量遠高于理論計算值，大量磁珠分散在緩沖體系中未得到有效利用，造成了浪費。在今后的研究中一方面要增加抗體的親和力，另一方面要研究免疫磁珠的再生，測試不同洗脫試劑的洗脫效率，以及磁珠使用次數和捕獲效率的關系，進而降低使用成本，促進免疫磁珠在致病菌檢測中的應用和推廣。