宮頸活組織病理檢查及免疫組化P16蛋白檢測在高危型人乳頭瘤病毒陽性病人中的意義

王海瑋，柴麗麗，楊國青，陳燕

宮頸癌是嚴重威脅女性生命健康的惡性腫瘤之一,近年來,越來越多的流行病學資料顯示,高危型人乳頭瘤病毒(HPV)感染與子宮頸癌及癌前病變的發生密切相關,而我國是世界上HPV感染率較高的國家之一，因此高危型HPV的檢測對于宮頸癌及癌前病變的篩查顯得尤為重要。此外,在日常診斷工作中,宮頸上皮鱗狀上皮化生,尤其是不成熟鱗化與宮頸上皮病變的鑒別,是困擾病理醫師的一個難題。研究表明,持續性感染HPV會導致P16的過度表達。本研究通過免疫組化法檢測P16蛋白在高危型HPV感染者中的表達,以探討它們在宮頸癌篩查和診斷中的價值及意義。

1 資料與方法

1.1一般資料對西安市中心醫院婦科門診2016年1月至2016年12月期間薄層液基細胞學技術(liquid-based ThinPrep cytology test,TCT)和第二代雜交捕獲法(HC2)二聯檢測中發現高危型HPV陽性的226例病人行常規子宮頸活檢,并聯合免疫組化檢測P16蛋白的表達。病人病理切片及免疫組化均由兩位高年資病理診斷醫師共同給出最終診斷結果。本研究得到了西安市中心醫院醫學倫理委員會批準，病人或其近親屬簽署了知情同意書。

1.2宮頸細胞學檢查采用TCT進行檢測,診斷標準采用TBS(the Bethesda system)分類法。分為無宮頸上皮內病變(negative for intraepithelial lesion or malignancy,NILM),未明確診斷意義的不典型鱗狀上皮細胞(atypical squamous cell,ASU),低度鱗狀上皮細胞病變(low squamous intraepithelial lesion,LSIL),高度鱗狀上皮病變(high squamous intraepithelial lesion,HSIL)。

1.3高危型HPV檢測所有標本均由婦科醫師用專用細胞采集器采取，HC2法定量檢測13種HPV-DNA含量(包括HPVl6、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68型)。陰陽性對照標本均由試劑盒提供。HPV DNA高危型檢測試劑盒及HC2基因雜交捕獲儀均購自美國Digene公司。結果判斷標準：HPV-DNA≥1.0 pg/mL為陽性；HPV-DNA<1.0 pg/mL為陰性。

1.4免疫組織化學方法采用MaxVision法檢測P16蛋白。所有標本經4%甲醛溶液固定,常規石蠟包埋,4 μm切片備用,染色步驟按照試劑盒說明書操作。抗體及試劑盒均購自福州邁新生物技術有限公司。

P16表達定位于細胞核或細胞質,鱗狀上皮無表達時記錄為(-),僅基底層和副基底層可見散在少量細胞P16陽性時記錄為(+),10%～90%的上皮細胞表達時為(++),≥90%的上皮細胞彌漫表達時記錄為(+++)。

1.5統計學方法采用SPSS 19.0統計軟件進行數據的處理與分析,采用非參數的Kruskal Wallis秩和檢驗，兩兩比較采用Bonferroni校正，P<0.001為差異有統計學意義。

2 結果

2.1宮頸細胞學檢查結果NILM72例,ASU32例,LSIL77例,HSIL45例。

2.2宮頸活檢結果病理活檢為炎癥/萎縮者73例,低級別上皮病變者98例,高級別上皮病變者55例。宮頸活檢結果與TCT結果比較見表1。

表1 宮頸活檢結果與TCT結果比較/例

從表1中可以看出,TCT結果為NILM者中,病理活檢陽性有7例,漏診率約為9.7%(7/72)。

2.3P16蛋白表達情況P16蛋白在宮頸活檢中的表達見表2。在炎癥/萎縮病變中,P16多無表達(圖1)；低級別病變中,大多數病例P16為局灶陽性,且陽性細胞占據鱗狀上皮的下1/3(圖2)；而高級別病變中,P16則為彌漫陽性(圖3)。

圖1 P16蛋白在萎縮中無表達(HE×100)

圖2 P16蛋白在低級別病變中的表達(HE×100)

圖3 P16蛋白在高級別病變中的表達(HE×100)

表2 P16蛋白在宮頸活檢中的表達

Kruskal Wallis秩和檢驗結果顯示,P16蛋白表達在炎癥/萎縮組、低級別病變組及高級別病變組間差異有統計學意義(χ2=158.29，P<0.001)；三組病變間的兩兩比較，采用Bonferroni校正后，P16蛋白表達均差異有統計學意義(P<0.001)。

3 討論

宮頸癌是女性生殖系統最常見的惡性腫瘤之一,幾乎所有子宮頸癌組織中均能檢測到HPV DNA[1],從而驗證了HPV是子宮頸癌的重要病因,尤其是高危型HPV感染是宮頸癌發生的必要條件[2]。目前已被鑒定出的HPV類型已超過100種,依其致病性不同可將其分為高危型和低危型兩大類,一般認為,高危型HPV如HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等,與宮頸癌及宮頸上皮病變的發生密切相關；低危型HPV如HPV6、11、42、43等,則常引起生殖道濕疣等良性病變。女性生殖系統HPV感染很常見,但大部分婦女在感染后8～10個月可以自行消除,約5%～10%的持續感染者才成為子宮頸癌的高危人群。自20世紀50年代以來,發達國家已廣泛開展宮頸癌涂片篩查,其流行病學數據顯示,宮頸浸潤癌的發病率和死亡率已明顯下降[3]；我國宮頸癌的普查率較低,尚未形成成熟的篩查模式[4],因此盡早發現高危型HPV感染,積極治療宮頸癌前病變,是我國當前預防宮頸癌的重點。

宮頸細胞學檢查和高危型HPV檢測是臨床宮頸病變篩查的常規手段,由于細胞學診斷受診斷醫師主觀因素影響較大,使得其重復性稍差。有研究認為在 HR-HPV 陽性、 TCT 陰性者中高級別上皮病變的檢出率明顯高于 HR-HPV陰性、 TCT 陽性者[5-6]。目前檢測HPV的方法主要有：聚合酶鏈式反應(PCR)技術、雜交捕獲技術(Hybrid Capture)、基因芯片導流雜交技術等。雜交捕獲技術已經被美國食品藥品管理局(FDA)批準,用于30歲以上女性宮頸癌的初篩。將高危型HPV檢測作為常規篩查手段,可以比通常采用的宮頸液基細胞學檢測更有效地濃縮高風險人群,降低漏診率[7]。本研究結果顯示,226例高危型HPV感染者中,TCT結果未發現宮頸上皮病變者為72例,而其中病理活檢陽性者有7例,漏診率約為9.7%(7/72),與上述研究結論一致。因此HPV(+)者,尤其HPV和TCT均(+)者,應及時行宮頸活檢。

P16基因定位于人染色體9p21,編碼P16蛋白，負性調節細胞周期從G1期進入S期。研究表明,P16基因的異常甲基化參與了多種腫瘤的發生和發展[8]。宮頸組織中P16的強陽性表達往往提示HPV在宿主細胞中的整合[9]。大部分學者的研究報告顯示，P16散在點狀弱陽性常常預示低危型HPV感染的低級別CIN,而P16彌漫性或帶狀強陽性表達則預示高危型HPV感染的高級別CIN[10-11]。因此P16可以作為一種輔助標志物，聯合HR-HPV檢測,有效分流薄層液基細胞中的ASUS病人[12-14]。本研究結果顯示，P16的陽性率在炎癥/萎縮組、低級別病變組及高級別病變組間的表達差異有統計學意義,其表達程度隨病變級別的進展而升高,說明P16與宮頸病變的級別密切相關,與陸曉青等[15]的研究結果一致。此外，在高級別及低級別病變組，P16的表達明顯高于宮頸炎癥/萎縮組，且表達類型以彌漫陽性或帶狀陽性為主,不同于炎癥/萎縮組的點灶表達或無表達，故P16表達也有助于宮頸上皮病變與炎癥/萎縮的鑒別。

隨著宮頸癌篩查的普及，HC2法檢測高危型HPV可作為臨床宮頸病變篩查的常規手段，HR-HPV陽性者應及時行陰道鏡下活組織檢查,必要時聯合應用免疫組化行P16蛋白檢測，以提高診斷的準確率,早期發現癌前病變、早期干預。