基于HPLC波長切換法對養胃寧膠囊中6種成分的質量控制研究

孫輝，何勝利

養胃寧膠囊系香附(醋)、水紅花子(炒)、草豆蔻、香椽、當歸等12味中藥材加工而成，收載于《衛生部頒藥品標準》中藥成方制劑第十三冊，具有調中養胃、理氣止痛的功效，其適應證主要為急慢性胃炎、潰瘍病，胃神經官能癥等疾病，臨床療效顯著[1]。養胃寧膠囊現行標準未對方中藥物成分進行定量測定研究，王英偉等[2]僅對該制劑中所含大黃酚進行了含量測定，未檢索到對養胃寧膠囊中多成分定量測定的文獻報道。方中香附[3-4]為莎草科植物莎草的干燥根莖，具有疏肝解郁、理氣寬中、調經止痛的作用，主要用于脾胃氣滯、脘腹痞悶、脹滿疼痛、肝郁氣滯、胸脅脹痛等癥狀的治療；水紅花子[3]為蓼科植物紅蓼的干燥成熟果實，具有消積止痛、利水消腫、散血消癥的功效，主要用于食積不消、胃脘脹痛、水腫腹水等癥狀的治療；草豆蔻[3,5]溫中止嘔、燥濕行氣，香椽[3]舒肝理氣、寬中化痰。筆者2016年1月至2017年1月采用HPLC波長切換法，對養胃寧膠囊主要藥味香附所含主要成分α-香附酮，水紅花子所含指標性成分花旗松素，草豆蔻的指標性成分山姜素、喬松素、小豆蔻明和榿木酮進行了同時測定研究，所建立的方法操作簡便、準確，重復性好，為養胃寧膠囊質量標準的提高提供了數據支持。

1 儀器

Agilent1100型高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；BP211DAG型電子天平，德國Sartorius公司；KQ-500DE型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

2 試藥與試劑

養胃寧膠囊(規格：每粒裝0.3 g，批號：160501、170101、170601)來源于通化茂祥制藥有限公司；對照品花旗松素(批號：111816-201102，含量：98.9%)、山姜素(批號：110762-201405，含量：97.5%)、喬松素(批號：111829-201703，含量：99.5%)、小豆蔻明(批號：110763-201604，含量：99.8%)、榿木酮(111830-201703，含量：99.8%)、α-香附酮(批號：110748-201714，含量：99.4%)均來源于中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，其它試劑為分析純。

3 方法與結果

3.1溶液的制備

3.1.1對照品溶液 分別精密稱取花旗松素對照品、山姜素對照品、喬松素對照品、小豆蔻明對照品、榿木酮對照品、α-香附酮對照品各適量，用甲醇溶解并制成質量濃度為0.436、1.578、1.314、0.978、1.152、0.358 mg/mL的單一組分對照品儲備液。再精密吸取各對照品儲備液2.5 mL，置同一50 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得養胃寧膠囊檢測用混合對照品溶液。

3.1.2供試品溶液 取養胃寧膠囊適量，傾出內容物，取約2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇50 mL，密塞，稱重，超聲(功率：500 W，頻率：40 kHz)提取30 min，放冷，擦干外壁，用甲醇補足減失重量，搖勻，過濾，續濾液作為養胃寧膠囊供試品溶液。

3.1.3陰性樣品溶液 按照養胃寧膠囊的處方和制備工藝，分別制備缺水紅花子(炒)陰性樣品、缺草豆蔻陰性樣品和缺香附(醋)陰性樣品，再按照“3.1.2”項下養胃寧膠囊供試品溶液制備方法制成水紅花子陰性樣品溶液、草豆蔻陰性樣品溶液和香附陰性樣品溶液。

3.2色譜條件采用Agilent Eclipse XDB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；流動相A：甲醇，流動相B：0.1%磷酸溶液，梯度洗脫(0～10 min，36.0%A；10～14 min，36.0%A→48.0%A；14～30 min，48.0%A→62.0%A；30～37 min，62.0%A→70.0%A；37～45 min，70.0%A→36.0%A)；0～30 min在300 nm[3,6-7]波長下檢測花旗松素、山姜素、喬松素、小豆蔻明和榿木酮，30～45 min在242 nm[8-11]波長下檢測α-香附酮；流速：0.9 mL/min；柱溫：25 ℃；進樣量為10 μL。

3.3方法學考察

3.3.1專屬性考察 精密量取“3.1”項下制備的混合對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各適量，依法進樣測定，結果見圖1，陰性樣品溶液均無干擾，理論塔板數按所測各成分計均不低于3 000，所測各成分花旗松素、山姜素、喬松素、小豆蔻明、榿木酮和α-香附酮色譜峰均能達到有效分離，分離度均大于1.5。

注：a.混合對照品溶液；b.養胃寧膠囊；c.水紅花子陰性樣品溶液；d.草豆蔻陰性樣品溶液；e.香附陰性樣品溶液;1.花旗松素；2.山姜素；3.喬松素；4.小豆蔻明；5.榿木酮；6.α-香附酮

圖1養胃寧膠囊HPLC色譜圖

3.3.2線性關系考察 分別精密吸取“3.1.1”項下制備的花旗松素、山姜素、喬松素、小豆蔻明、榿木酮和α-香附酮對照品儲備液各0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，置于20 mL量瓶中，用甲醇制成25倍濃度差的6個混合對照品溶液，依法進樣測定，采用花旗松素、山姜素、喬松素、小豆蔻明、榿木酮和α-香附酮質量濃度c為橫坐標，所測各成分峰面積A為縱坐標，繪制標準曲線進行回歸計算，回歸方程分別為花旗松素：A=8.5594×105c+427.1；山姜素：A=1.6057×106c+256.9；喬松素：A=1.7365×106c-372.8；小豆蔻明：A=1.3219×106c+281.7；榿木酮：A=1.5698×106c-277.1；α-香附酮：A=9.0572×105c+169.4。花旗松素、山姜素、喬松素、小豆蔻明、榿木酮和α-香附酮分別在2.18～54.50 μg/mL(r=0.999 9)、7.89～197.25 μg/mL(r=0.999 6)、6.57～164.25 μg/mL(r=0.999 8)、4.89～122.25 μg/mL(r=0.999 7)、5.76～144.00 μg/mL(r=0.999 9)、1.79～44.75 μg/mL(r=0.999 1)范圍內線性關系良好。

3.3.3精密度試驗 取“3.1.1”項下制備的養胃寧膠囊檢測用混合對照品溶液，依法進樣測定花旗松素、山姜素、喬松素、小豆蔻明、榿木酮和α-香附酮峰面積，結果所測6個成分峰面積的RSD分別為1.11%、0.95%、1.02%、0.98%、0.83%和1.26%。

3.3.4穩定性試驗 取養胃寧膠囊(批號：160501)的同一供試品溶液，分別在室溫下第0、2、4、8、12和16 h進樣，結果養胃寧膠囊供試品溶液室溫下16 h穩定，所測各成分花旗松素、山姜素、喬松素、小豆蔻明、榿木酮和α-香附酮峰面積的RSD分別為1.05%、0.88%、0.95%、1.11%、0.67%和1.20%。

3.3.5重復性試驗 取養胃寧膠囊(批號：160501)，按照“3.1.2”項下制備方法制備養胃寧膠囊供試品溶液6份，依法進樣測定，記錄花旗松素、山姜素、喬松素、小豆蔻明、榿木酮和α-香附酮峰面積，計算所測各成分含量，結果所測各成分含量的RSD分別為1.46%、0.59%、0.82%、1.39%、1.27%和0.96%。

3.3.6加樣回收率試驗 取已知含量的養胃寧膠囊(批號：160501)，傾出內容物，取6份，每份約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入花旗松素對照品溶液(0.514 mg/mL)0.5 mL、山姜素對照品溶液(0.905 mg/mL)1.0 mL、喬松素對照品溶液(0.762 mg/mL)1.0 mL、小豆蔻明對照品溶液(0.561 mg/mL)1.0 mL、榿木酮對照品溶液(0.659 mg/mL)1.0 mL和α-香附酮對照品溶液(0.417 mg/mL)0.5 mL，再按照“3.1.2”項下養胃寧膠囊供試品溶液制備方法制備加樣回收樣品溶液，依法進樣測定，計算所測各成分花旗松素、山姜素、喬松素、小豆蔻明、榿木酮和α-香附酮加樣回收率，結果見表1。

表1 花旗松素、山姜素、喬松素、小豆蔻明、榿木酮、α-香附酮的回收率

3.4養胃寧膠囊的含量測定取批號為160501、170101、170601的養胃寧膠囊，按照“3.1.2”項下養胃寧膠囊供試品溶液制備方法制備供試品溶液，依法進樣測定，記錄花旗松素、山姜素、喬松素、小豆蔻明、榿木酮和α-香附酮峰面積，采用外標法計算所測各成分含量，結果見表2。

表2 含量測定結果/(mg/g)

4 討論

4.1養胃寧膠囊供試品溶液制備方法的優化本實驗考察了不同提取溶劑(甲醇[3,7-9]、70%甲醇、乙醇[12]、70%乙醇[13])對養胃寧膠囊中所測成分花旗松素、山姜素、喬松素、小豆蔻明、榿木酮和α-香附酮提取率的影響，對比結果顯示甲醇的提取效果優于其他提取溶劑；在此結果基礎上，對養胃寧膠囊供試品的提取方式(超聲提取[2,7-8]和加熱回流提取[3])和提取時間(15 min、30 min和45 min)進行了對比考察，最終優選養胃寧膠囊供試品溶液最佳的制備方法為甲醇溶液超聲提取30 min，此條件下所測成分花旗松素、山姜素、喬松素、小豆蔻明、榿木酮和α-香附酮的綜合提取率最佳。

4.2色譜條件中流動相的優化本實驗對比考察了甲醇-水[3,7-9,13-14]、乙腈-水[15]等度洗脫，以所測成分花旗松素、山姜素、喬松素、小豆蔻明、榿木酮和α-香附酮的峰形、分離度以及色譜峰基線平穩等為評價指標，結果甲醇-水流動相優于乙腈-水流動相體系，但所測成分α-香附酮峰形較差，喬松素色譜峰分離效果欠佳；在此結果基礎上，筆者又分別考察了甲醇-0.1%磷酸溶液[16-17]、甲醇-0.1%冰醋酸溶液為流動相，同時采用梯度洗脫方法，對流動相的比例進行不斷摸索，最終確定采用甲醇-0.1%磷酸溶液為流動相，按照文中“3.2”項下的規定的程序梯度洗脫，此條件下所測色譜峰基線平穩，所測成分花旗松素、山姜素、喬松素、小豆蔻明、榿木酮和α-香附酮色譜峰峰形對稱，分離度符合要求。

本研究采用HPLC波長切換聯合梯度洗脫法，同時對養胃寧膠囊中6個成分花旗松素、山姜素、喬松素、小豆蔻明、榿木酮和α-香附酮的含量進行了測定，所建立的方法簡便、快捷，重復性好，靈敏度高，為養胃寧膠囊質量標準的提高提供了數據支持。