達比加群在家兔中的藥代動力學及其對實驗室檢查的影響

張培哲，曹邦明，李佳俊，張弛，夏明，楊向軍

長期以來維生素K拮抗劑如華法林長期應用于口服抗凝治療，但其治療窗窄、受食物藥物影響大、需定期檢測及調整藥物劑量、高出血風險等缺點和不足而限制臨床應用[1]，甚至在治療窗內仍有高達6%的嚴重出血事件發生[2]。近來新型口服抗凝藥物克服以上不足成為抗凝治療新選擇，其中達比加群為合成的非肽類小分子、可逆性、特異性直接凝血酶抑制劑，能抑制游離型和與纖維蛋白單體結合的凝血酶的活性[3]，因此比華法林和低分子肝素更好的發揮抗凝效果。其前體藥物達比加群酯無生物學活性，口服后經CES1和CES2兩種酯酶水解后可迅速轉化為有抗凝活性的達比加群[4]。RE-LY研究表明兩種劑量的達比加群酯兩天2次口服抗凝效果不劣于華法林且安全性更高，使更多的國家批準應用于臨床的抗凝治療[5]。目前達比加群的具體治療窗尚未界定，且不良事件的發生與血藥谷濃度相關[6]，比華法林有更高的胃腸道出血風險[2]，亦有其出血致死性事件的報道[7]，故仍需觀察達比加群的藥理學特性及通過實驗室檢查結果評估其抗凝作用。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1藥品和試劑 達比加群酯膠囊150 mg(商品名為泰畢全，批號507056)購自勃林格殷格翰公司(德國)，部分凝血酶原時間(APTT)試劑(批號114873RE)、凝血酶時間(TT)試劑(批號114393)、STA-ECA主試劑(批號114814RE)及相關定標品(批號114288)和質控品(批號114289)均購自stago公司(法國)，達比加群(批號1-JYS-153-1)和達比加群-d3(批號2-NOT-148-1)均購自TRC公司(加拿大)，羧甲基纖維素鈉，二甲基亞砜(DMSO)，乙酸銨、甲酸、乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為市售分析純。

1.1.2主要儀器 API 4000三重四極桿串聯質譜儀(美國AB SCIEX公司)；1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；STA Compact System全自動血凝儀(法國stago公司)。

1.2實驗方法

1.2.1實驗動物及分組 18只雄性新西蘭大白兔，普通級，體質量2.3～3.0 kg，均購自蘇州大學實驗動物中心(實驗動物生產許可證SYXK(蘇)2012-0062)，實驗前均常規飼養1周。實驗前禁食12 h，自由飲水。本研究中對于大白兔的處理符合動物倫理學標準。

1.2.2溶液配制 達比加群酯溶于0.4% DMSO和0.5% 羧甲基纖維素鈉配制成懸浮液，每次實驗前晚配制，4 ℃保存，現配現用。其他試劑配制參考各自說明書。

1.2.3實驗過程及標本處理 將實驗動物采用隨機數字表法分為對照組、5 mg/kg組和10 mg/kg組，每組6只。5 mg/kg組和10 mg/kg組分別灌胃5 mg/kg和10 mg/kg的達比加群酯溶液，對照組灌胃等體積的溶劑，分別于給藥前、給藥后0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24 h通過兔耳中央動脈采血2.7 mL，置于3.2%枸櫞酸鈉抗凝管中(1∶9)混勻后1 500×g離心20 min后取血漿分裝立即凍存于-70 ℃直至檢測。LC-MS/MS檢測前室溫溶解，其他實驗室檢查檢測前均37 ℃孵育15 min。

1.2.4藥代動力學檢測 采用LC-MS/MS法檢測達比加群藥物濃度，最小檢測濃度1 ng/mL。達比加群標準品用空白兔血漿配制成濃度范圍為0～5 000 ng/mL的定標品，達比加群-d3(內標品)配制成100 ng/mL的溶液，檢測過程參考Stangier等[8]方法并適量修改。取50 μL待檢測標本或定標品加入50 μL內標物混勻后再加入20 μL的0.2 N NaOH 37 ℃孵育2 h，然后加入30 μL的0.2 N HCl和200 μL的甲醇充分混勻2 min后13 000×g離心10 min，取10 μL上清進行LC-MS/MS上機檢測。色譜條件：色譜柱Venusil MP C18(2.1 mm×150 mm，5.0 μm)，流動相A液(5 mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸溶液)和流動相B液(乙腈-0.1%甲酸溶液)梯度洗脫：0～1 min，5% 流動B液；0～1 min，5% 流動B液；1～1.5 min，95% 流動B液；1.5～3.5 min，95% 流動B液；3.5～3.6 min，5% 流動B液，流速0.3 mL/min。質譜分析采用電噴霧離子化源正離子和多反應監測模式掃描，用于定量分析的離子對分別為達比加群m/z 472.0→289.0和達比加群-d3 m/z 475.6→292.2，總體分析時間5 min。

表1 各實驗組的主要藥代動力學參數

1.2.5實驗室檢查結果檢測 采用STA Compact System全自動血凝儀檢測APTT、TT及達比加群濃度[蛇靜脈酶發色底物法(ECA)]，具體步驟參照各自說明書，每次檢測前均做定標和質控。

2 結果

2.1藥代動力學檢測結果兩實驗組主要藥代動力學參數見表1，平均藥物濃度-時間曲線見圖1。

圖1 平均血藥濃度-時間曲線

2.2各組TT比值隨時間變化曲線與對照組相比，給藥后TT-時間曲線隨藥-時曲線有類似的變化，提示達比加群在體內抗凝效果無時間延遲(圖2)。

圖2 TT隨時間變化曲線

2.3實驗室結果與LC-MS/MS相關性分析相關性分析提示APTT與LC-MS/MS檢測的血藥濃度呈低度相關(R2=0.224，圖3)且高濃度時易超出儀器檢測上限；TT與LC-MS/MS檢測血藥濃度呈高度相關(R2=0.780，圖4)，低濃度時即顯著延長；ECA檢查結果與LC-MS/MS檢測結果相關性分析提示兩者呈高度相關(R2=0.882，圖5)，但高濃度時(LC-MS/MS檢測結果>300 ng/mL)無法得出ECA結果，Bland-Altman偏倚性分析圖顯示絕大多數ECA檢查結果低于LC-MS/MS的檢測結果(圖6)。

圖3 APTT與LC-MS/MS對應的散點圖

圖4 TT與LC-MS/MS對應的散點圖

圖5 ECA與LC-MS/MS對應的散點圖

圖6 Bland-Altman偏倚性分析圖

3 討論

達比加群為新型小分子非肽類可逆性直接凝血酶抑制劑，其藥理學特征是可預測和可重復的，很少受食物藥物影響且治療窗廣，無需常規監測藥物濃度，但在臨床中出現一些特殊情況如懷疑藥物過量、急診手術、致死性大出血等情況時，有效的實驗室檢查檢測其抗凝效果仍十分必要[1，9]。而RE-LY研究表明口服達比加群酯的不良事件的發生與血藥谷濃度相關[6，10]，故檢測藥物谷濃度可一定程度的避免不良事件的發生。

Stangier等[11]和Blech等[12]均指出與葡糖醛酸結合(結合型)的達比加群和游離型的達比加群有同樣的藥理學活性，也有研究指出對比游離型的達比加群，結合型的達比加群對APTT有類似的延長作用[13]，同時Stangier[14]亦指出達比加群的葡萄苷酸化并不影響其臨床療效，因此總體達比加群濃度可能更精確的反應體內的抗凝效果。本實驗采用LC-MS/MS檢測總達比加群的血藥濃度，結果表明達比加群在新西蘭大白兔中的藥代動力學特性與其他動物和人相似[14-15]，提示達比加群在不同物種間有相似的藥代動力學且是可預測的，這也為在新西蘭大白兔模型中研究達比加群抗凝效果提供一定的理論依據。同時各組TT-時間曲線顯示出與藥-時曲線類似的趨勢，提示達比加群的抗凝效果無時間延遲，這也與其他研究結果一致[11]。雖然LC-MS/MS為藥物檢測金標準[16]，但其儀器設備昂貴，操作及維修保養要求高，很難在大多數實驗室普及[1]，故本研究同時采用ECA檢測達比加群的血漿藥物濃度[17]并探討兩者檢測結果的相關性。研究表明ECA檢測不受待檢測血樣中凝血酶原和纖維蛋白原含量的影響，利用ECA檢測達比加群的血漿藥物濃度可有效的排除凝血因子缺乏時的影響[18]。本實驗相關性分析顯示LC-MS/MS與ECA呈高度相關性，提示ECA可在一定程度上作為達比加群定量的指標，與Sinigoj等[10]和Hawes等[19]的研究結果一致，Bland-Altman偏倚性分析顯示ECA低估藥物濃度，與其他研究結果相符[17]，提示ECA不能反映總體的達比加群血藥濃度，而Skeppholm 等[20]分別比較ECA與游離型和總體的達比加群血藥濃度，得出ECA在人血漿中檢測的為總達比加群血藥濃度的結論，與本研究的結果不一致，這可能是由于種屬間的差異及應用不同的定標品和質控品引起，目前尚缺乏相關的研究證實ECA反映哪一種達比加群血藥濃度。

APTT與LC-MS/MS檢測的血藥濃度相關性分析提示兩者有一定的敏感性，但相關性弱，且變異性大，正常范圍的APTT值亦不能排除存在達比加群，因此其不適合作為定量檢測達比加群的指標，但APTT的顯著延長，甚至超過儀器檢測上限，提示存在高血藥濃度，而TT與達比加群濃度有很好的劑量相關性，低濃度的達比加群即引起TT顯著延長，故在排除其他引起TT值延長的情況，TT可作為達比加群的定性指標，這也與其他研究結果相符[8，11]，雖然本研究TT值未超儀器檢測上限，但以人為研究對象的研究中，TT在高濃度時易超出檢測上限[21-22]，故結合臨床實際，TT不適合作為達比加群定量的指標。

本實驗對象為新西蘭大白兔，考慮不同物種間可能存在差異，為此本實驗APTT和TT均采用比值以減少實驗誤差，但不同實驗室及不同檢測試劑所測結果間存在較大差異[22]，應用本實驗結果解釋臨床資料時需慎重。

綜上所述，達比加群的藥代動力學是可預測的且在體內抗凝效果無時間延遲；APTT不適合作為定量檢測達比加群的指標，但其值顯著升高提示高濃度的達比加群；TT可作為達比加群的定性指標；ECA可在一定程度上作為達比加群定量的指標，但需進一步的研究和探討。