發酵玉米蛋白粉飼料的枯草芽孢桿菌紫外誘變選育

王 松 ， 江成英 *， 鄭喜群 ， 劉曉蘭 ， 許紅麗 ， 董 楠 ， 張忠月

（1.齊齊哈爾大學食品與生物工程學院，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾大學農產品加工黑龍江省普通高校重點實驗室，黑龍江齊齊哈爾161006）

玉米蛋白粉飼料作為蛋白質飼料中重要的一種，由于其中含有大量蛋白質成分被廣泛應用（林謙等，2013），但是其中的蛋白質大部分為醇溶蛋白不能被動物吸收與利用。通過微生物發酵的方法可降解玉米蛋白粉中的醇溶蛋白，能夠顯著提高玉米蛋白粉飼料的利用率 （江成英等，2018）。本研究通過紫外線誘變育種的方法來篩選得到產蛋白酶活力有明顯提高的枯草芽孢桿菌（王雅君等，2013），用以發酵玉米蛋白粉飼料，以期提高玉米蛋白粉飼料的醇溶蛋白降解率，進而提高其動物利用率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 本試驗采用的菌種為齊齊哈爾大學生物工程實驗室保藏的枯草芽孢桿菌。

1.1.2 實驗儀器 紫外可見分光光度計（日本島津儀器廠），電熱恒溫水浴鍋（上海躍進醫療器械廠），高速離心機 （北京京立離心機有限公司），PHS-25數顯pH計 （上海精密科學儀器有限公司），BS224S型電子天平 （北京賽多利斯儀器廠），ZD-8801振蕩器（太倉科教器材廠），隔水式電熱恒溫培養箱（上海躍進醫療器械廠），不銹鋼壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠），超凈工作臺（上海智城分析儀器有限公司），旋渦混合器（北京市金北德工貿易有限公司）等。

1.1.3 培養基 LB培養基：胰蛋白胨1%，酵母粉5%，氯化鈉 1%，pH為7.0。固體培養基加入2%的瓊脂。121℃滅菌30 min；脫脂牛奶培養基：A：5 g脫脂牛奶與 50 mL蒸餾水混合；B：2 g瓊脂溶于50 mL蒸餾水。A，B分別115℃滅菌20 min，冷卻至60℃混勻后倒平板。

1.2 方法

1.2.1 菌種生長曲線測定 由于菌懸液中的菌體濃度在一定范圍內與菌懸液渾濁度成正比，所以采用比濁法測定原始菌株的生長曲線 （朱艷蕾，2016）。

1.2.2 致死率曲線測定 制備菌懸液，使用紫外燈對菌懸液進行不同時間（0～90 s）的照射，每隔5 s進行一次取樣，稀釋之后進行平板涂布。將平板倒扣培養進行菌落計數，繪制致死率曲線。

1.2.3 突變株的篩選 將誘變處理后的菌株涂布于脫脂牛奶平板上。計算透明圈直徑與菌落直徑的比值，篩選出產蛋白酶活力較強的菌株。

1.2.4 酶活力測定 蛋白酶活力采用福林酚法進行測定。

1.2.5 傳代穩定性試驗 將篩選出的菌株傳代并測定其酶活，評定該突變菌株的遺傳穩定性（劉天祎，2017）。

1.2.6 發酵驗證試驗 將誘變獲得的菌株11-1接入玉米蛋白粉中進行固態發酵，以驗證其對玉米蛋白粉飼料的發酵能力。

2 結果與分析

2.1 原始菌種的生長曲線 進行紫外誘變處理時，一般要求誘變菌種應處于對數生長期，此時的菌種對于紫外線更敏感，更容易發生突變，而且處于對數生長期的菌種代謝能力強，相對穩定，生長速度快繁殖旺盛，易于做重復試驗。

由圖1所示，0～4 h期間菌體濃度幾乎無變化，此時菌種處于生長適應期。從5 h開始菌種出現迅速增長，可知原始菌種的對數生長期為5～24 h，24 h后菌種生長速度減緩，進入穩定期，進行紫外誘變時應選擇對數中前期的菌種進行誘變，所以選擇經過14 h培養的菌懸液進行紫外誘變處理。

圖1 枯草芽孢桿菌生長曲線

2.2 致死率曲線 進行紫外誘變育種時應當選擇使菌種致死率達到80%的紫外光照射時間為最佳誘變劑量。當菌種致死率達到80%，菌種的變異概率大，更易發生突變。

如圖2所示，隨著紫外照射時間的增加，菌種的死亡率逐漸增加，當照射時間達到55 s時，致死率達到79.62%，當照射時間達到70 s時菌種死亡率達到100%。因此采用55 s為最佳誘變劑量進行下一步誘變育種試驗。

圖2 枯草芽孢桿菌致死率曲線

2.3 高產蛋白酶突變菌株篩選 根據脫脂牛奶篩選培養基上透明圈直徑與菌落直徑的比值，篩選出5株產蛋白酶活力較強的菌株，結果見表1。

表1 高產蛋白酶突變菌株篩選結果

其中突變株11-1的透明圈直徑與菌落直徑比值與原始菌株相比變化最大，達到10.86，該透明圈與菌體直徑的比值表示該菌種產蛋白酶對蛋白質的水解能力，透明圈與直徑比值越大則說明該菌株產蛋白酶活力越大。經過測量之后發現11-1的比值與原始菌株相比有明顯提高，則說明經過紫外誘變育種之后原始菌株的產蛋白酶能力得到了明顯的提高，較原始菌株透明圈與菌落直徑比值6.67相比提高了約1.63倍。

2.4 突變菌株的酶活力測定 將篩選出的突變株接入液體LB培養基中培養，取培養液離心取其上清液測定酶活力。

如表2所示，篩選出的5株突變株中，突變株11-1與22-4產蛋白酶活力相差不多，11-1相對更高，所以選用11-1進行下一步遺傳穩定性試驗。11-1產蛋白酶活力較原始菌株21.515 U/mL提高最大，數值達到35.301 U/mL，說明原始枯草芽孢桿菌經過紫外誘變育種之后產蛋白酶能力得到了明顯的提升，較原始菌株提高了約1.66倍。

表2 突變株蛋白酶活力U/mL

2.5 遺傳穩定試驗 對突變株11-1進行連續傳代培養，驗證其遺傳穩定性，結果見表3。

表3 突變株11-1的遺傳穩定性U/mL

對突變菌株11-1連續傳代8次，其蛋白酶活力基本穩定。傳代第八次與原始菌株的酶活力相比有所降低，變化約為4.8%，變化幅度不顯著，證明連續傳代會對突變菌株11-1的產蛋白酶活力造成一定影響，但影響程度不大，可以認為高產蛋白酶突變株11-1遺傳性能良好，可做為發酵玉米蛋白粉飼料菌株。

2.6 發酵驗證試驗 將誘變所得對玉米蛋白粉進行發酵試驗，以驗證其發酵能力。將玉米蛋白粉和麩皮以 7∶3混合，料水比為 1∶1.2，接入 5%的11-1菌株，置于30℃發酵84 h，測定其可溶性蛋白含量，結果見表4。

表4 突變株11-1與原始菌株發酵能力比較%

由表4可知未經發酵的原料中可溶蛋白含量為3.97%，經過原始菌株發酵的飼料可溶蛋白含量為6.34%，可溶蛋白含量轉化率為37.39%。經過突變菌株11-1發酵的飼料中可溶蛋白含量為7.61%，可溶蛋白含量的轉化率為47.83%。可以看出經突變菌株11-1發酵過后的玉米蛋白粉飼料中的可溶蛋白含量較原始枯草芽孢桿菌相比有明顯提高。可以得出結論突變菌株11-1經紫外誘變后有更好的降解飼料能力，經11-1發酵過后的飼料能夠更容易被吸收，提高了玉米蛋白粉飼料的利用率，具有良好的發展前景。

3 結論

使用枯草芽孢桿菌所產生的蛋白酶在各個行業均已被大量應用（Schallmey等，2004）。本研究通過紫外誘變育種篩選出一株遺傳性狀穩定的較原始菌株產蛋白酶能力有明顯提高的枯草芽孢突變菌株11-1。經測定該菌株的透明圈直徑比值為10.86，較原始菌株擴大1.63倍；蛋白酶活力為35.301 U/mL，較原始菌株的蛋白酶活力提高1.66倍。通過連續傳代試驗發現其蛋白酶活力變化率為4.8%，變化幅度不顯著，證明其遺傳性能穩定。發酵試驗表明，經突變菌株11-1發酵的玉米蛋白粉中可溶蛋白轉化率為47.83%，較未誘變的原始菌株提高了10.44%。表明紫外誘變育種技術能夠有效的提高枯草芽孢桿菌的產蛋白酶能力，并且能夠穩定遺傳，可用于發酵玉米蛋白粉飼料的生產，為微生物發酵生產玉米蛋白粉飼料奠定了基礎。