超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測飼料中喹烯酮和喹乙醇

劉雪紅， 宋 平， 孫進(jìn)健

（大連市獸藥飼料監(jiān)察所，遼寧大連 116037）

目前，飼料中喹乙醇與喹烯酮的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫分析法（趙春保等，2008）、高效液相色譜法（劉發(fā)全等，2008）、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 （2349號公告-6，2015；2086號公告-5，2014）。免疫分析法樣品前處理簡單、檢測速度快，但容易產(chǎn)生假陽性或假陰性的結(jié)果；液相色譜法靈敏度較低，檢出限較高；液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法是應(yīng)用較廣泛的檢測飼料中喹 啉類藥物的方法。文獻(xiàn)報道較多的是采用HLB固相萃取柱凈化，樣品前處理需配制多種試劑，操作步驟多，而且凈化所用固相萃取柱使用前需活化，備用液過柱后，需淋洗。整個前處理過程較長，費時費力。本文采用PRiME HLB固相萃取柱凈化，Atlantis T3色譜柱分離，僅需配制1種試劑，無需氮吹，且所用的固相萃取柱無需活化和淋洗，分析速度快、回收率高，能滿足定性、定量的要求。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備 電子天平RD-200，德國Sartorius公司；超聲波清洗器 KQ-250B，昆山市超聲儀器有限公司；立式低溫高速離心機CF16RN，日立公司；數(shù)顯強力渦旋混合器 MS3，德國 IKA公司；液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀UPLC XEVO TQ-S，美國Waters公司；色譜柱 Atlantis T3（2.1 mm×150 mm 5μm），美國Waters公司；色譜柱 ACQUITY UPLC BEH C18 （2.1mm×50mm 1.7μm），美國Waters公司；固相萃取柱 Oasis PRiME（HLB 3 mL 60 mg）。

1.2 藥品與試劑

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品 喹乙醇批號H0061103，含量99.5%；喹烯酮 批號H0561305，含量99.6%，均來自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2.2 供試品

1.2.2.1 空白樣品 乳豬配合飼料：遼寧禾豐牧業(yè)股份有限公司，經(jīng)檢測不含喹乙醇和喹烯酮。

1.2.2.2 空白添加樣品 分別按照0.2、0.4、2 mg/kg的比例在空白樣品中添加喹乙醇和喹烯酮標(biāo)準(zhǔn)品，混勻。

1.2.3 試劑 甲醇、乙腈、甲酸色譜純，水為符合GB/T 6682規(guī)定的一級水。

0.1%甲酸溶液：量取1.0 mL甲酸與1000 mL水，混勻。 0.1%甲酸-乙腈（2+8）溶液：量取200 mL 0.1%甲酸溶液與800 mL乙腈，混勻。0.1%甲酸-乙腈（8+2）溶液：量取 800 mL 0.1%甲酸中溶液與200 mL乙腈，混勻。

1.2.4 混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液（1000 μg/mL） 分別準(zhǔn)確稱取喹乙醇和喹烯酮對照品各10 mg，于10 mL棕色容量瓶中，加2 mL二甲亞砜溶解，并用甲醇定容。-20℃密封避光保存，有效期為3個月。

1.2.5 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液配制（10 μg/mL） 精密量取1.2.4項下混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液1 mL用乙腈稀釋定容100 mL。-20℃密封避光保存，有效期為3個月。

喹烯酮和喹乙醇均對光敏感，見光易分解，所以在整個實驗過程中必須避光操作，所用的器皿應(yīng)盡可能采用棕色。

1.3 樣品檢測

1.3.1 樣品處理

1.3.1.1 提取 稱取2.00 g試樣 （精確至0.01 g），于聚丙烯離心管中，加入0.1%甲酸-乙腈溶液（2+8）20 mL， 渦動 1 min，40℃ 超聲波清洗儀中超聲10 min。9000 r/min下離心15 min，備用。

1.3.1.2 凈化 精密量取1 mL上清液，直接過PRiME HLB固相萃取柱，收集全部流出液，精密量取3 mL水與之混勻，過0.22 μm濾膜供上機檢測。

1.3.2 液相色譜條件 色譜柱：Atlantis T3，柱溫：30℃，進(jìn)樣量：5 μL，梯度洗脫程序見表 1。

表1 梯度洗脫程序

1.3.3 質(zhì)譜條件 離子掃描方式：正離子，檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測，霧化器壓力：7.0 Bar，干燥氣流量：650 L/h，干燥氣溫度：400℃，毛細(xì)管電壓：3000 V定性、定量離子對和錐孔電壓及碰撞能量見表2。

表2 定性、定量離子對和錐孔電壓及碰撞能量

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密量取1.2.5混合標(biāo)準(zhǔn)工作液逐級稀釋，以1.2.3.3稀釋液定容配制成濃度分別為 5、20、80、200、500 ng/mL 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，混勻后上機測定。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 以特征離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（ng/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2種藥物在5～500 ng/mL時線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均在0.996以上（表3）。

表3 2種藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)

2.2 檢測限和定量限 添加適量混合標(biāo)準(zhǔn)工作液于空白飼料中，經(jīng)提取后測定。根據(jù)特征質(zhì)量色譜峰的信躁比S/N＞3為檢測限，信躁比S/N＞10為定量限，檢測到2種藥物的檢測限為0.06 mg/kg，定量限為0.2 mg/kg。空白飼料中添加0.2 mg/kg的2種藥物特征離子質(zhì)量色譜圖見圖1。

圖1 空白飼料中添加0.2 mg/kg的2種藥物特征離子質(zhì)量色譜圖

2.3 回收率及重復(fù)性實驗 在空白飼料中添加3個不同濃度（0.2、0.4、2 mg/kg）2 種藥物，進(jìn)行回收率實驗，每個添加濃度做5個平行，連續(xù)測定3批，其平均回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差見表4。從表中實驗結(jié)果可以看出2種藥物的添加回收率為80%～95.5%，批內(nèi)批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%。

3 討論

3.1 選用Atlantis T3色譜柱分離，2種藥物峰形均良好。見圖1。采用C18色譜柱分離，喹烯酮峰形良好，喹乙醇受基質(zhì)干擾，峰形很差，見圖2。

3.2 采用目前的方法進(jìn)行檢測，與文獻(xiàn)中報道的液相色譜質(zhì)譜法比較，減少試劑的使用及操作步驟，節(jié)省試劑和時間，提高了檢測效率。前處理方法比較見表5。

表4 2種藥物回收率及重復(fù)性實驗結(jié)果（n=5）

圖2 2種藥物（添加0.2 mg/kg）采用BEH C18色譜柱分離特征離子質(zhì)量色譜圖

3.3 基質(zhì)效應(yīng)研究 由于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜存在基質(zhì)效應(yīng)，而且飼料樣品基質(zhì)復(fù)雜，因此對樣品基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行研究。比較3個不同條件下的信號峰面積：純的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，樣品基質(zhì)提取后添加，樣品基質(zhì)提取前添加。在優(yōu)化實驗條件下，用空白樣品按“1.3.1”方法制作空白基質(zhì)，加入一定量標(biāo)準(zhǔn)溶液，制成基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液；在空白樣品中加入一定量標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“1.3.1”方法制成基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液；與相應(yīng)濃度的純標(biāo)準(zhǔn)溶液比較。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無明顯基質(zhì)效應(yīng)，因此定量時采用純的標(biāo)準(zhǔn)品曲線。

表5 2種前處理方法比較

4 結(jié)論

該檢測方法，定量限為0.2 mg/kg，在0.2、0.4、2 mg/kg添加水平下，喹乙醇和喹烯酮平均回收率為80%～95.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%。實驗流程更簡單、更快速、更有效，適合大批量日常分析檢測。