利用CRISPR/Cas9技術構建環指蛋白126基因敲除小鼠

高夢樵， 艾東旭， 李 鈺， 孫 菲， 王 進， 范君文， 袁 征， 劉 源， 孫兆增

(1. 軍事醫學研究院實驗動物中心， 北京 100071;2. 塔里木大學生命科學學院， 阿拉爾市 843300)

環指蛋白 126(ring finger protein 126， RNF126)是一種E3泛素連接酶， 與泛素激活酶E1、泛素結合酶E2共同參與真核生物體內特定蛋白的泛素化，從而誘導蛋白的降解。近期研究[1-4]表明， RNF126在許多腫瘤性疾病的發病中起關鍵性作用。抑制人類舌癌細胞SCC9與SCC25中RNF126基因的表達可以使癌細胞的增殖能力和活性下降[3]。在人乳腺癌組織中RNF126高度表達，并可同時作為判定侵潤性乳腺癌預后不良的生物標記物[4]。有研究[5]顯示在腦膠質瘤組織中，RNF126的表達顯著高于正常腦組織。Rnf126位于小鼠的第10號染色體，其表達產物可通過促進產生非同源末端連接(NHEJ)以及同源重組(HR)的方式加快修復內源性或外源性因素造成的DNA雙鏈斷裂(DSB)[6]。但目前對于RNF126基因的作用靶點和作用機制的相關信息有待深入研究。

繼鋅指核酸酶(ZFNs)技術以及轉錄激活因子樣效應物核酸酶(TALENs)技術兩種基因定點修飾技術之后，CRISPR/Cas9[clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated(Cas9)]技術以簡單易行、成本低廉以及高效率等優點成為了近年來的熱門基因編輯技術，并被應用于基礎研究、生物工程、疾病模型構建以及基因治療等領域[7]。該項技術的原理是， 由20～24個可變堿基組成的sgRNA以RNA-DNA配對的方式定位[8]， 引領Cas9核酸內切酶[9]通過識別靶點處的PAM(protospacer adjacent motif)序列，同時核酸內切酶對靶序列進行切割，隨后機體以NHEJ或HR的方式修復后產生精確且永久的突變[10]。本研究擬利用CRISPR/Cas9技術，建立Rnf126基因缺陷的小鼠模型，為進一步分析研究RNF126基因可能的作用靶點和作用機制奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

3.5～4 周齡雌性C57BL/6小鼠30只; 8～12周齡雄性C57BL/6小鼠1只; 8～12周齡ICR結扎雄鼠15只; 8～12周齡ICR母鼠15只，均來自軍事科學院軍事醫學研究院實驗動物中心[SCXK(軍)-2017-0004]。

1.2 主要實驗試劑及儀器

MEGA shortscriptTMT7 High Yield Transcription Kit(LOT：00652532)、mMESSAGE mMACHINETMT7(LOT：00642281)、MEGAclearTMKit(LOT：00672844)、PurelinkTMQuick Plasmid Miniprep Kit(LOT：00653130)均購自美國Invitrogen公司。SacI(LOT：AGY0812A)、ApaI(LOT：AGX0144A)、DraI(LOT：K355AA)限制性內切酶均購自日本TaKaRa公司。BsaI(LOT：0371509)限制性內切酶購自美國New Englant BioLabs公司。2× ES Taq Master Mix(LOT：01031/50301)、Mouse Tail Genomic DNA Kit(LOT： 50142)均購自康為世紀生物科技有限公司。Gel ExtractionKit(LOT：00D2500010000H01P026)購自美國Omega公司。BMTOP10 Competent Cell(LOT： 725964FF)、Golden View(LOT： 191847BB)以及相關引物均購自博邁德公司。注射用孕馬血清激素(PMSG)以及注射用人絨毛膜促性腺激素(hCG)(生產批號： S180115， S171208)均購自寧波三生生物科技有限公司。體視顯微鏡(型號： smz-168TLED)購自德國麥克奧迪公司。顯微注射用顯微鏡(型號：DP71)購自日本奧林巴斯公司。拉針儀(型號P-1000)購自美國Sutter公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 Rnf126基因敲除引物設計以及sgRNA表達載體的構建 根據NCBI中提供的參考基因組可知鼠源Rnf126基因全長8 497 bp(NC_000076.6)，利用crispr.mit.edu網站在Rnf126基因的第四外顯子內設計一對互補的敲除引物(引物序列為： 5'-CCAGTCTCGGCATCGGTACG-3')，并為引物添加黏性末端序列(上游5'端添加“TAGG”， 下游3'端添加“AAAC”)，以用于連接pUC57載體。以逐步降溫的方式使引物退火形成雙鏈，并用質粒提取試劑盒提取pUC57質粒，然后使用BsaI對pUC57質粒進行酶切，膠回收后獲得線性化pUC57載體。將退火后引物與線性化pUC57載體進行連接，并將連接后的重組質粒轉化到感受態細胞中，通過卡那抗性固體培養基平板篩選菌株，后挑取單克隆菌株培養并取部分菌液送以測序。

1.3.2 sgRNA以及Cas9 mRNA的獲得 使用質粒提取試劑盒提取構建好的sgRNA表達載體，用DraI對表達載體進行酶切并進行回收。同樣從含有pST1374-N-NLS-flag-linker-Cas9質粒的菌液中提取Cas9質粒，后用SacI以及ApaI對質粒進行雙酶切并使用乙醇沉淀法回收酶切產物。分別用MEGAshortscriptTMT7 High Yield Transcription Kit以及mMESSAGE mMACHINETMT7對線性化后的sgRNA表達載體以及Cas9質粒進行體外轉錄，并使用MEGAclearTMKit獲得純度及濃度良好的sgRNA以及Cas9 mRNA。

1.3.3 小鼠超數排卵、顯微注射以及胚胎移植 通過腹腔注射的方式向預先準備好的30只3.5～4周齡雌性C57BL/6小鼠注射PMSG以及hCG，每只的注射劑量約為10 U， 兩次注射時間間隔為48 h。將注射激素后的雌鼠以及1只8～12周齡C57BL/6雄鼠在給藥后18 h處死，分別收集雌鼠的輸卵管膨大部和雄鼠的附睪，在體式顯微鏡下分別取出卵子和精子。使精子在獲能液中獲能后，取液體邊緣精子滴加入短暫培養的卵細胞中，體外受精3～4 h。將制備好的sgRNA與Cas9 mRNA分別用無RNA酶水稀釋至25 ng/μL和50 ng/μL。通過顯微注射的方式將RNA導入到受精卵的細胞質中，并移植到與結扎雄鼠合籠的見栓ICR母鼠輸卵管膨大部，縫合后將移植母鼠飼養于IVC環境中。

1.3.4 子代工程鼠的基因型鑒定 仔鼠出生后約21 d，對其進行耳號標記， 并剪下0.5 cm鼠尾組織， 使用Mouse Tail Genomic DNA Kit提取鼠尾基因組。并利用引物設計軟件設計一對鑒定用PCR擴增引物(上游引物序列：5'-CCGGCAGCCATTTGAGGTGAG-3'，下游引物序列： 3'-TTCGGAATT GGGAGTGCTACA-5'，產物長度603 bp)。使用2× ES Taq Master Mix構建PCR擴增體系， 并在PCR儀上運行如下程序： 95 ℃5 min， 94 ℃ 30 s， 58 ℃ 40 s， 72 ℃ 1 min， 34 次循環擴增， 72 ℃ 5 min。對擴增結果進行克隆測序。

1.3.5 工程鼠的飼養與擴大繁殖 通過對F0代工程鼠的鑒定，篩選出基因完全敲除的Founder鼠，并與野生型C57BL/6小鼠進行交配。在所獲得的F1代小鼠中，利用上述鑒定方法再對其敲除情況進行鑒定，篩選出敲除情況相同且性別不同的小鼠進行近交，以達到規模化繁育的目的。

2 結果

2.1 成功構建針對小鼠Rnf126基因的sgRNA表達載體

從菌液的測序結果(圖1)可知， 菌液中攜帶的重組載體中插入了針對鼠Rnf126基因所設計的敲除引物序列， 成功獲得了Rnf126基因 sgRNA表達載體。

2.2 成功獲得sgRNA以及Cas9 mRNA

通過體外轉錄及純化回收，成功獲得了高濃度且純度良好的sgRNA及Cas9 mRNA，濃度約為1 200 mg/L和800 mg/L， 電泳檢測結果如圖2所示。

2.3 子代工程鼠基因型鑒定

顯微注射后，收獲了82枚受精卵，將這些卵移植至3只見栓代孕ICR母鼠的雙側輸卵管膨大部。待其生產后，共獲得F0代仔鼠11只。對其進行基因型鑒定后，選出一只單鏈缺失62個堿基的敲除鼠作為Founder鼠，其PCR產物峰圖及序列比對圖如圖3和圖4所示。該鼠缺失位于Rnf126基因的4849～4910處。在其出生后70 d與野生型C57BL/6雌鼠1∶2合籠。所得F1代仔鼠基因型PCR鑒定結果如圖5所示， 雜合子電泳結果可在約600 bp的位置清晰可見兩條電泳條帶，而野生型僅有一條。證明該缺失可被穩定遺傳。

2.4 氨基酸序列預測分析

圖1 sgRNA表達載體測序結果

圖2 Rnf126 sgRNA以及Cas9 mRNA電泳圖

利用ORF Finder網站(http：//www.bioinformatics.org/sms2/orf_find.html)對基因敲除前后所編碼的氨基酸序列進行分析。從分析結果可知，野生型小鼠的Rnf126基因編碼313位氨基酸。敲除鼠因發生了移碼突變， 導致從第122位密碼子起， 編碼的氨基酸出現改變。突變還導致在該基因的第178位密碼子后提前出現終止密碼子。

3 討論

圖3 Founder鼠Rnf126基因相關區域的測序結果

圖4 Founder鼠與Rnf126基因序列比對圖

圖5 F1代工程鼠PCR鑒定圖

近年來，RNF126基因的生物學功能研究成為熱門。許多癌變組織中都檢測到了RNF126的高度表達。RNF126基因之所以與腫瘤細胞的增殖密切相關， 可能有兩方面原因。首先， RNF126的作用底物主要包括p21等腫瘤抑制因子， 通過降解這些底物從而促進了腫瘤細胞的增殖[11]。其次，RNF126與另外一種E3泛素連接酶BCA2有著相似的蛋白質結構， 而BCA2與乳腺癌的發病有著密切的聯系， 故推測RNF126可能與BCA2有著相似的生物學功能[12]。同時，RNF126是一種DNA雙鏈斷裂修復蛋白，在放療和化療過程中細胞內的RNF126會以促進同源重組或非同源末端連接等易錯修復方式進行修復，這也給癌癥疾病的預后造成了不良影響[4]。在本研究中，針對小鼠Rnf126基因的第四外顯子內設計了一對sgRNA敲除引物，利用CRISPR/Cas9技術，通過顯微注射的方式將體外合成的sgRNA以及Cas9 mRNA導入到小鼠受精卵中，成功建立了Rnf126基因缺失的C57BL/6小鼠模型，為探尋RNF126與腫瘤疾病的關系這一研究方向上提供一種全新的哺乳動物模型，便于更加系統、全面地研究RNF126基因及其表達產物的生物學功能。

本研究利用CRISPR/Cas9技術在C57 BL/6小鼠的Rnf126基因中實現了62個堿基的敲除。在前期獲取RNA的實驗中，我們均采用乙醇沉淀的方法去純化回收體外轉錄所需的線性化模板，該方法具有以下優點： ①可以保證模板的回收效率。切膠回收雖然可回收特定的DNA模板但是無法達到很高的回收濃度，較高的回收濃度對獲取高濃度、可儲存的RNA是必需的。另外對于體外轉錄實驗，無需單一回收特定的線性化模板，使用該方法回收全部產物后，轉錄酶會去特異地識別載體上的啟動子序列，僅對特定的模板進行轉錄。②可以更好控制模板的回收純度。通過使用體積分數75%乙醇對回收產物進行一次或多次的洗滌，可以很好獲得高純度的模板，保證了體外轉錄實驗的成功率;在顯微注射的準備工作中，我們將用于注射的RNA樣品進行高速離心以使雜質沉淀，這樣可降低堵針的概率并提高注射后受精卵的存活率。

在進行基因篩選時，我們選取一只單鏈缺失62個堿基的雄鼠用于其后的建系繁育。經分析，該缺失全部位于小鼠Rnf126基因的第四外顯子內，且缺失數非3的倍數，在缺失了大量堿基的基礎上還造成了移碼突變。通過對氨基酸序列的分析可知，該突變導致Rnf126基因從第122位密碼子起，編碼的氨基酸發生改變，發生改變的氨基酸共計57個，且在第178位密碼子后提前出現終止密碼子，從而沉默了135個密碼子的表達，嚴重干擾了RNF126蛋白的正常合成。在對F1代工程鼠的基因型鑒定中，我們發現雜合缺失小鼠的數量與野生型小鼠的數量大致呈1∶1，證明該突變被穩定遺傳。在F2代小鼠的基因型鑒定中，由于用于繁育的陽性小鼠數量較少，暫時沒有得到雙鏈缺失的純合子個體。待得到純合子后，擬檢測純合子小鼠及野生型小鼠之間RNF126蛋白的表達差異并進行其相關生物學功能研究。