SPF金黃倉鼠種群的建立及質量控制

張華瓊， 夏 爽， 吳燕茹， 何 凡

(成都生物制品研究所有限責任公司， 成都 610023)

乙型腦炎(乙腦)活疫苗系用乙腦病毒減毒株(SA14-14-2株)接種原代倉鼠腎細胞，經培養、收獲病毒液，加入適宜穩定劑凍干制成[1]。生產過程中使用的毒種、細胞基質、血清和胰酶等動物源性原材料的外源因子污染是所有活疫苗生產中普遍關注的問題。世界衛生組織(WHO)技術報告系列(TRS)現行版TRS980(附錄7)為人用乙腦減毒活疫苗生產和質量控制提供了指南，其中，10～14日齡金黃倉鼠作為乙腦活疫苗生產用主要起始原材料，所用動物的13種病毒[2]應為陰性。為加速我國生產的人用疫苗得到世界的認可，2006年國藥中生成都公司與美國適宜衛生科技組織(PATH)合作，開展乙腦活疫苗預認證工作。其中，建立SPF級金黃倉鼠種群是認證工作中的一個重要環節。

1 材料與方法

1.1 原有金黃倉鼠A種群

本單位金黃倉鼠一直用于乙腦減毒活疫苗的生產，并適應于SA14-14-2疫苗株的培養。種群最初來源于北京生物制品研究所，普通級，封閉群;2003年首次通過剖宮產手術凈化，自建SPF金黃倉鼠種群(A)，以降低疫苗外源因子污染的風險。A種群于屏障系統內飼養，常年保持4 000只繁殖母鼠，為乙腦疫苗生產提供10～14日齡動物。本研究隨機選取20對40～60日齡A種群金黃倉鼠。

1.2 引進代乳鼠

根據動物生產的實際情況，結合外籍專家的建議，擬定6對動物按照既定的遺傳矩陣配種，以建立新種群(B)。2010年10月從德國Charles River公司引進40～60日齡SPF級金黃倉鼠20只(8只雄性，12只雌性)，于隔離器內飼養。

1.3 配種

2010年11月，代乳鼠先后2周分2批配種，每批6只雌鼠，用作代乳鼠。

本單位原有A種群金黃倉鼠20對分2批先后同步配種，作為供胎鼠，用于剖宮產。

1.4 剖宮產及代乳

檢查受孕情況， 推算預產期， 一旦代乳鼠分娩，立即檢查原有金黃倉鼠，結合腹部觸診，選擇臨產前母鼠實施剖宮產手術，取出仔鼠(定義為F0);同時淘汰代乳鼠的幼崽，將F0轉移到代乳鼠籠盒內。因為代乳鼠只有7只先后妊娠，2010年12月，先后實施剖宮產手術一共代乳7窩(表1)。

1.5 傳代

F0離乳后雌雄分別飼養，2個月后從2#～7#代乳鼠后代各挑選2對， 分別以A、C、E、G、I、K 表示F0(♀)遺傳信息， 以L、B、D、F、H、J分別表示F0(♂)的遺傳信息(表1)， 按照既定的方式進行配種， 6 對 /組， 共兩組(1 組備用)， 生產出F1， 以此類推， 經過6次傳代配種，F6具備全部6對動物(F0)的遺傳信息(A～L)。具體配種方式見圖1。

表1 金黃倉鼠的剖宮產和代乳情況Table 1 Caesarean and foster nursing in golden hamster 只

圖1 配種矩陣圖Figure 1 Mating matrix

1.6 擴群

自F6起，同窩留單一性別，隨機交配，于2013年5月建立核心種群(312對)，同時逐步轉種到生產群(屏障環境)，并于2014年7月全部替換原有A種群持續供應乙腦活疫苗生產。

1.7 種群質量控制措施

1.7.1 廠房設計 SPF動物生產二車間(B207)由法國Technip工程公司按照國際標準設計和監理，建筑面積3 700 m2，專門用于SPF金黃倉鼠生產繁殖。車間為局部二層結構，二樓為D級背景，內置28臺隔離器(56個隔離包)，用于核心群保種，配備UPS，確保不間斷供電。一樓為屏障環境，有6個飼養單元(150 m2/單元)，每個單元擁有獨立的空調系統，常年保持4 000只母鼠繁殖，為乙腦疫苗生產提供10～14日齡幼鼠。

1.7.2 人員管理 人員經過充分培訓， 持證上崗， 定期體檢， 無人畜共患病， 人員經洗澡、更衣進入潔凈區，隔離器操作戴手套，與動物無直接接觸。

1.7.3 環境監測 飼養人員每日觀察房間實際溫濕度壓差情況，中控報警系統24 h監控各項環境參數，確保符合國家標準規定。每月檢測沉降菌，確保清潔消毒效果。

1.7.4 驗證校驗 定期驗證校驗， 確保HVAC、隔離器、高壓鍋、各種儀表正常有效運行。

1.7.5 維修維保 設施設備定期計劃性維護保養， 日常故障及時維修處理。

1.7.6 消毒滅菌 各種物料(籠具、用具、飲水、墊料、飼料)進入潔凈區前都必須經過清潔消毒/高壓滅菌/輻照處理。不同種類消毒劑輪換使用; 消毒滅菌工藝經過驗證; 對飲水、墊料的高壓滅菌效果定期進行無菌檢查; 對飼料原材料和成品料按要求進行營養成分分析和無菌檢查。

1.7.7 3C管理 任何變更(CC)要進行風險評估， 及時發現不符合性(N C)，并采取糾正預防措施(CAPA)。

1.8 動物質量檢測

1.8.1 采用哨兵動物法監測動物種群質量 選取4～6周齡雌性倉鼠作為哨兵動物，每個隔離包1盒，每盒2～3只，籠盒擱置在離排風口較近的地方，在每次更換籠盒時， 將其臟墊料分散到被監控的全部動物的干凈籠盒中，確保所有動物與哨兵動物“100%”接觸，以最大限度地代表整個群體的質量。

1.8.2 本單位QC檢測 每季度抽取哨兵動物，每個隔離包1～2只，按照國家標準要求采樣，檢測細菌、病毒、寄生蟲。

1.8.3 委托檢測 定期抽取哨兵動物，每個隔離包1只，采集被毛/皮屑、血清、氣管/氣管分泌物、腸道內容物等樣品， 每半年國內委托檢測1次， 每年國外委托檢測1次。國外委托檢測病毒學項目19個，細菌學項目16個，寄生蟲學項目6個。

2 結果

2.1 核心群(隔離環境)

常年保持312對繁殖倉鼠，定期向生產群提供種子。

2.2 生產群(屏障環境)

常年保持4 000只繁殖母鼠，平均每窩產仔數11只，年供應10～14日齡倉鼠16～20萬只。

2.3 國外委托檢測

病毒學、細菌和寄生蟲的檢測方法及結果分別見表2，表3和表4。

3 討論

預認證是指WHO通過對申請產品的安全性、有效性和免疫效果作出評價后，能夠作為國際機構采購疫苗的資質確認，通過預認證后，疫苗可以由聯合國相關機構采購提供給相關國家使用。其主要審核標準是TRS頒布的技術指導意見，這是世界各國專家組成員以個人身份在廣泛的醫療和公共衛生問題方面向WHO提供的最新科學技術意見，其目的是確保聯合國采購供應疫苗的安全性、有效性和 “100%”的質量保證[5]。

為貫徹執行《中國生物制品規程》( 2000年版) 于生物制品生產和檢定用實驗動物必須使用清潔級動物的規定，上海率先進行了普通級金黃倉鼠的凈化[6]，本單位于2003年建立SPF金黃倉鼠種群(A)， 也是通過對普通級金黃倉鼠實施剖宮產、外購SPF金黃倉鼠代乳培育而成，微生物凈化級別符合SPF動物國家標準要求，國外委托檢測淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒、仙臺病毒、小鼠肺炎病毒、呼腸孤病毒Ⅲ型、漢坦病毒、小鼠細小病毒、大鼠K病毒、猴病毒5、小鼠腦脊髓炎病毒、吐蘭病毒、逆轉錄病毒等11種病毒陰性[7]， 但是多瘤病毒、支原體、分支桿菌等項目[2]也是TRS980的要求， 而且在種群建立時沒有進行遺傳控制， 也沒有建立完整的種群資料和記錄。為配合乙腦項目WHO預認證，需要重新建立SPF金黃倉鼠種群(B)。

表2 病毒學檢測方法及結果Table 2 Virological items, methods and results

表3 細菌學檢測方法及結果Table 3 Bacteriological items、methods and results

表4 寄生蟲學檢測方法及結果Table 4 Parasitological items、methods and results

剖宮產-代乳是常用生物凈化方法之一，一方面要盡早淘汰代乳鼠自己的幼崽， 另一方面， 剖宮產取出的胎兒個體要足夠大，數量不宜過多，以提高成活率。待手術的孕鼠數量要充足，如果剖宮取出的胎兒數量過多個體太小，則立即淘汰，另選其它孕鼠再實施剖宮產，以便選擇較好的胎兒用于代乳。另外，將剖宮產的胎兒與代乳鼠的幼崽接觸一下，可以減少代乳鼠“食仔”情況。

乙腦活疫苗生產使用的是原代倉鼠腎細胞(PHK)， SPF金黃倉鼠的微生物攜帶狀況直接影響產品，其中病毒直接影響疫苗的安全和質量， 所以病毒學項目的篩查尤為重要，新種群排除了19種病毒，遠遠多于國家標準要求的4種病毒。

按照國家標準要求，SPF金黃倉鼠需要排除13種細菌，同時WHO TRS980還特別要求排除支原體和分支桿菌，其中分支桿菌的檢測是由本單位QC進行的， 主要采集倉鼠腎臟和肺臟直接培養，結果均為陰性。

國產疫苗國際化是中國疫苗界的夢想，疫苗生產單位如果要申請預認證，疫苗生產和檢定用動物必須符合中國藥典和WHO TRS980的要求，其中注射用活疫苗生產用金黃倉鼠必須至少排除以上13種病毒(表2序號1-13)，尤其是逆轉錄病毒，此要求將載入2020年版中國藥典。

本單位金黃倉鼠剖宮產凈化手術一直選擇原有種群， 外購動物僅僅用作代乳，一方面是為了確保遺傳背景清楚， 另一方面是不用變更疫苗生產用原材料。本次剖宮產凈化的金黃倉鼠B種群已先后送中國食品藥品檢定研究院和上海伯豪生物技術有限公司進行遺傳檢測，遺傳質量分析工作還在進行中。