鹿茸干預(yù)去卵巢骨質(zhì)疏松癥模型大鼠的實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)

曲雷鳴， 龔 偉

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院， 沈陽(yáng)110032)

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(p o s t-me n o p a u s a l osteoporosis， PMOP) 是指絕經(jīng)后婦女由于卵巢功能減退， 雌激素水平下降，從而導(dǎo)致骨吸收大于骨形成，出現(xiàn)以低骨量和骨組織顯微結(jié)構(gòu)退行性變?yōu)槠涮卣鳎谴嘈院凸钦垡赘行栽黾拥囊环N全身代謝疾病。中醫(yī)學(xué)并無(wú)“骨質(zhì)疏松癥”這一明確病名的記載，現(xiàn)代學(xué)者根據(jù)骨質(zhì)疏松癥所表現(xiàn)的腰背酸痛、身長(zhǎng)縮短、駝背及易于發(fā)生骨折等癥狀， 將其歸屬于中醫(yī)學(xué)“骨痿”、“骨痹”范疇。研究表明，骨質(zhì)疏松癥病理機(jī)制之一在于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)與TGF-β1誘導(dǎo)早期反應(yīng)基因1(TIEG1)mRNA及蛋白表達(dá)異常，并可能存在下丘腦-腎-骨的反饋調(diào)節(jié)機(jī)制[1]，鹿茸具有壯腎陽(yáng)、益精血、強(qiáng)筋骨的功效[2]，常用于骨質(zhì)疏松癥的治療，本論文以去卵巢骨質(zhì)疏松癥大鼠為研究對(duì)象，探討鹿茸對(duì) TGF-β1以及TIEG1相關(guān)性的實(shí)驗(yàn)研究。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雌性SD大鼠50只，未交配，體質(zhì)量220～250 g，購(gòu)于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司[SCXK(遼)2015-0001]。飼養(yǎng)室溫度 18～22 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，明暗循環(huán)12 h∶12 h[SYXK(遼)2013-0009]。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑

鹿茸藥材由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院李峰教授提供， 產(chǎn)地吉林; 中藥陽(yáng)性對(duì)照藥仙靈骨葆片(淫羊藿、續(xù)斷、丹參、知母、補(bǔ)骨脂、地黃)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)同濟(jì)堂(貴州)制藥有限公司(批號(hào)： 160709); 西藥陽(yáng)性對(duì)照藥補(bǔ)佳樂(lè)(戊酸雌二醇)購(gòu)自法國(guó)Delpharm Lille S.A.S 公司(批號(hào)： 287A)。

1.3 主要儀器與試劑

XR-36型雙能骨密度儀購(gòu)自美國(guó)Northland公司; Infinite M2000多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自?shī)W地利Tecan公司; MR1822低溫高速離心機(jī)購(gòu)自法國(guó)Jouan SA公司; DIAX90 型勻漿機(jī)購(gòu)自德國(guó)Heidolph公司; BL1500電子天平購(gòu)自北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司; 大鼠TIEG1試劑盒(批號(hào)201706)、大鼠TGF-β1試劑盒(批號(hào)201706)均購(gòu)于上海聯(lián)碩生物科技有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 模型建立 大鼠適應(yīng)環(huán)境7 d后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為5組，每組10只，正常組(正常組+蒸餾水)，模型組(去卵巢+蒸餾水)，仙靈骨葆(去卵巢+仙靈骨葆)，補(bǔ)佳樂(lè)組(去卵巢+補(bǔ)佳樂(lè))，鹿茸組(去卵巢+鹿茸)。大鼠肌肉內(nèi)注射10%水合氯醛(3.5 mL/kg體質(zhì)量)， 麻醉。模型組和實(shí)驗(yàn)組大鼠經(jīng)腰脊部?jī)蓚?cè)行縱向切口， 行去卵巢手術(shù)， 術(shù)后肌肉注射青霉素1.6 mL/kg體質(zhì)量(80萬(wàn)單位∶4 mL生理鹽水)，連續(xù)注射3 d。正常組不進(jìn)行手術(shù)。

1.4.2 給藥方法 給藥前， 鹿茸藥材粉碎，過(guò)80目篩，加50 ℃溫水，制成0.1 g/mL的混懸液，備用；鼠經(jīng)造模術(shù)后7 d開(kāi)始給藥，每日上午灌胃給藥 1次，連續(xù)給藥12周。各組鹿茸給藥劑量為每日0.4 g/kg; 補(bǔ)佳樂(lè)組給藥劑量為每日0.2 mg/kg;仙靈骨葆組給藥劑量為每日0.3 g/kg; 正常組與模型組灌胃等體積蒸餾水。實(shí)驗(yàn)期間，各組大鼠每周稱(chēng)重一次，并根據(jù)體質(zhì)量變化調(diào)整給藥劑量。

1.4.3 指標(biāo)檢測(cè) ① 股骨： 取大鼠右后肢股骨帶股骨頭，迅速剔除所附著的肌肉和筋膜，軟組織剔除干凈但盡量不破壞骨膜，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%氯化鈉溶液沖洗，濕紗布包裹，外包錫紙，-70℃保存應(yīng)用XR-36型雙能骨密度儀進(jìn)行骨密度(BMD)檢測(cè)。②下丘腦、腎、股骨： 分別取大鼠下丘腦、腎、左后肢股骨，組織分別與一定比例生理鹽水共同置組織研磨器中， 在冰水浴中進(jìn)行研磨，制成10%的組織勻漿液，靜止后離心， 取上清液， -70 ℃保存。采用酶聯(lián)免疫(ELISA)法對(duì)下丘腦、腎、骨組織中TIEG1蛋白活性進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，單因素方差分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMD測(cè)定

大鼠去勢(shì)13周后，與正常組比較，模型組大鼠骨密度顯著降低(P＜0.05); 與模型組相比，鹿茸組、仙靈骨葆組均能顯著增加大鼠骨密度(表1)。

2.2 TIEG1、TGF-β1 含量

大鼠去勢(shì)13周后，與正常組比較，模型組大鼠骨、腎、下丘腦中TIEG1、TGF-β1指標(biāo)水平顯著降低(P＜0.05); 與模型組相比，鹿茸組、仙靈骨葆組、補(bǔ)佳樂(lè)組TIEG1、TGF-β1指標(biāo)水平均能顯著增加(表2)。

表1 大鼠離體股骨骨密度測(cè)定

表2 骨、腎、下丘腦組織中TIEG1、TGF-β1蛋白活性檢測(cè) ng/L

3 討論

傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)理論解釋說(shuō)明了“腎”與“骨”的密切關(guān)系， 即腎主骨，骨的強(qiáng)弱與腎中精氣盛衰關(guān)系密切， 故眾多實(shí)驗(yàn)多從“腎”和“骨”的角度入手， 既闡明了“腎主骨，生髓”的內(nèi)在機(jī)制，又為補(bǔ)腎生髓法治療骨質(zhì)疏松癥提供了理論基礎(chǔ)。沈自尹[3]的研究表明，骨質(zhì)疏松癥的病理機(jī)制還與下丘腦-垂體-性腺軸有密切關(guān)。鄭洪新等[1]研究結(jié)果提示，骨質(zhì)疏松癥病理機(jī)制之一在于TGF-β1與TIEG1 mRNA及蛋白表達(dá)異常， 并可能存在下丘腦-腎-骨的反饋調(diào)節(jié)機(jī)制， 揭示骨的生長(zhǎng)發(fā)育與腎精-腦髓-骨髓密切相關(guān)的部分生物學(xué)依據(jù)。

TGF-β是多肽類(lèi)生長(zhǎng)因子的一種，屬于抑炎細(xì)胞因子， 功能多重復(fù)雜，目前認(rèn)為其是骨吸收與骨形成的耦聯(lián)因子，可以促進(jìn)成骨細(xì)胞分化增殖，在骨重建中起重要作用， 維持骨穩(wěn)態(tài)[4]。TIEG作為T(mén)GF-β誘導(dǎo)的早期轉(zhuǎn)錄基因，引起細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡，在成骨細(xì)胞中TIEG1 的表達(dá)對(duì)于成骨細(xì)胞介導(dǎo)的礦化以及成骨細(xì)胞支撐的破骨細(xì)胞分化至關(guān)重要[5]。研究表明，骨細(xì)胞可調(diào)節(jié)骨質(zhì)疏松模型家兔TGF-β1、TIEG1的蛋白表達(dá)[6]。但目前關(guān)于TGF-β1、TIEG1與骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)性研究較少。

本研究選擇取材下丘腦、腎、骨， 研究鹿茸對(duì)TGF-β1與TIEG1相關(guān)性以及各組織間的異同。結(jié)果表明， 模型組骨、腎組織、下丘腦組織TGF-β1、TIEG1 mRNA及蛋白表達(dá)明顯降低，應(yīng)用鹿茸干預(yù)12周后， 可明顯上調(diào)骨、腎組織、下丘腦組織TGF-β1、TIEG1 mRNA及蛋白表達(dá)水平，對(duì)下丘腦-腎-骨具有明顯的調(diào)控作用，從而闡明中醫(yī)學(xué)“腎藏精生髓主骨”藏象理論對(duì)臨床實(shí)踐的指導(dǎo)意義。